Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

- Сфероиды — это трехмерные модели клеточных культур in vitro. Для иммунофлуоресцентного окрашивания сначала сгенерируют сфероидную культуру нужного типа клеток в многолуночном планшете. С помощью микропипетки с широким наконечником отверстия соберите сфероиды, стараясь не допустить разрыва из-за сил сдвига.

Затем зафиксируйте и пропитайте сфероиды, чтобы сделать отдельные клетки проницаемыми. Теперь инкубируйте с раствором, содержащим белки для блокирования неспецифических участков взаимодействия белков на поверхности клетки. Обработайте сфероиды желаемым коктейлем первичных антител. Инкубируйте антитела, чтобы они связывались с молекулами-мишенями на поверхности клетки.

Затем пометьте сфероиды флуоресцентно меченным раствором вторичного антитела, специфичным для первичных антител. Наконец, обработайте сфероиды подходящим флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, чтобы окрашивать ядра клеток. С помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа можно получить изображение нескольких оптических сечений сфероида в разных оптических плоскостях.

Полученные изображения отражают флуоресцентно меченые ядра и антигены, представляющие интерес. Объедините стеки с помощью соответствующего программного обеспечения, чтобы получить окончательное составное изображение 3D-сфероида. В соответствии с данным протоколом мы выполним иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов фибробластов поджелудочной железы и ассоциированных с раком фибробластов, культивируемых в присутствии стимулятора TGF beta 1.

- Сначала отрежьте конец кончика пипетки, чтобы увеличить отверстие. После завершения инкубации используйте этот отрезанный наконечник для пипетки, чтобы собрать сфероиды в одну реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра, в зависимости от экспериментальных условий или для каждого анализируемого белка. Центрифугируйте сфероиды в 1000 раз больше g в течение примерно 30-60 секунд. Осторожно удалите надосадочную жидкость, содержащую метилцеллюлозу, с помощью пипетирования, следя за тем, чтобы не потревожить гранулированные сфероиды.

- Особую осторожность следует проявлять при переносе сфероидов в реакционные пробирки. Убедитесь, что у вас нет сил напряжения сдвига, разрезая кончик. Также важно, чтобы вы собрали все сфероиды. На этапе промывки убедитесь, что вы не теряете сфероиды при аспирации.

- Чтобы промыть сфероиды в дозе 50 микролитров 1X PBS, центрифугируйте в 1 000 раз g в течение 30-60 секунд, затем осторожно удалите PBS с помощью пипетирования. В зависимости от окрашиваемого белка зафиксируйте сфероиды либо 50 микролитрами 4% параформальдегида в PBS на 20 минут при комнатной температуре.

Промойте сфероиды PBS, как описано ранее. Пермеабилизируйте клетки 0,1% Triton X в PBS в течение 4 минут при комнатной температуре. Затем промыть сфероиды в ПБС трижды, как описано ранее. Добавьте PBS, содержащий 5% FBS и 2% BSA, к сфероидам и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы блокировать неспецифические участки взаимодействия белков.

Теперь инкубируйте сфероиды с 30 микролитрами первичных антител в PBS с 2,5% FBS и 1% BSA при 4 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день промойте сфероиды в PBS три раза, как описано ранее.

После этого сфероиды инкубируют с 30 микролитрами вторичных антител в PBS с 2,5% FBS и 1% BSA при комнатной температуре в течение 90 минут. Промойте сфероиды в PBS три раза, как описано ранее.

Далее инкубируйте клетки с 30 микролитрами окрашивающего раствора DAPI в течение 4 минут при комнатной температуре. Промойте сфероиды в PBS один раз, как описано ранее. С помощью стеклянной пастеровской пипетки поместите сфероиды на предметное стекло в каплю PBS. С помощью лазерного сканирующего микроскопа можно получить изображение сфероидов с помощью флуоресцентной микроскопии с увеличением в 10 раз. Возьмем различное оптическое сечение сфероида в разных оптических плоскостях Z-стека.