Почему проверка нулевой гипотезы важна для анализа экспрессии антигенов в сфероидах?

Проверка нулевой гипотезы позволяет объективно оценить, являются ли наблюдаемые различия в экспрессии антигенов в окрашенных сфероидах статистически значимыми, что способствует надежной валидации мишеней и снижает количество ложноположительных результатов на ранних этапах поиска.

Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочий процесс иммунофлуоресцентного окрашивания?

Изоляция таких переменных, как воздействие стимулятора или условия применения антител, гарантирует, что изменения в экспрессии антигена обусловлены конкретными экспериментальными факторами, что повышает достоверность механистических интерпретаций и последующих решений.

Что позволяют определить количественные измерения флуоресценции при анализе сфероидов?

Количественные измерения флуоресценции предоставляют объективные и воспроизводимые данные об уровнях внутри- и внеклеточных антигенов, что позволяет проводить сравнительный анализ в различных условиях и способствует обоснованному подбору мишеней на основе полученных данных.

Почему требования к воспроизводимости имеют решающее значение для межфункционального взаимодействия при 3D-окрашивании?

Репликация гарантирует, что результаты иммунофлуоресцентного окрашивания являются согласованными и воспроизводимыми для разных исследовательских групп, что способствует надежному обмену данными и принятию совместных решений в рамках междисциплинарных исследований.&D-среды.

Какие возможности статистического анализа требуются перед внедрением иммунофлуоресценции сфероидов?

Для оценки распределения интенсивности флуоресценции, сравнения экспериментальных групп и подтверждения результатов необходимы надежные инструменты статистического анализа, обеспечивающие принятие решений о внедрении на основе строгих количественных данных.

Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 4:29 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Сфероиды — это трехмерные модели клеточных культур in vitro. Для иммунофлуоресцентного окрашивания сначала сгенерируют сфероидную культуру нужного типа клеток в многолуночном планшете. С помощью микропипетки с широким наконечником отверстия соберите сфероиды, стараясь не допустить разрыва из-за сил сдвига.

Затем зафиксируйте и пропитайте сфероиды, чтобы сделать отдельные клетки проницаемыми. Теперь инкубируйте с раствором, содержащим белки для блокирования неспецифических участков взаимодействия белков на поверхности клетки. Обработайте сфероиды желаемым коктейлем первичных антител. Инкубируйте антитела, чтобы они связывались с молекулами-мишенями на поверхности клетки.

Затем пометьте сфероиды флуоресцентно меченным раствором вторичного антитела, специфичным для первичных антител. Наконец, обработайте сфероиды подходящим флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, чтобы окрашивать ядра клеток. С помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа можно получить изображение нескольких оптических сечений сфероида в разных оптических плоскостях.

Полученные изображения отражают флуоресцентно меченые ядра и антигены, представляющие интерес. Объедините стеки с помощью соответствующего программного обеспечения, чтобы получить окончательное составное изображение 3D-сфероида. В соответствии с данным протоколом мы выполним иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов фибробластов поджелудочной железы и ассоциированных с раком фибробластов, культивируемых в присутствии стимулятора TGF beta 1.

- Сначала отрежьте конец кончика пипетки, чтобы увеличить отверстие. После завершения инкубации используйте этот отрезанный наконечник для пипетки, чтобы собрать сфероиды в одну реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра, в зависимости от экспериментальных условий или для каждого анализируемого белка. Центрифугируйте сфероиды в 1000 раз больше g в течение примерно 30-60 секунд. Осторожно удалите надосадочную жидкость, содержащую метилцеллюлозу, с помощью пипетирования, следя за тем, чтобы не потревожить гранулированные сфероиды.

- Особую осторожность следует проявлять при переносе сфероидов в реакционные пробирки. Убедитесь, что у вас нет сил напряжения сдвига, разрезая кончик. Также важно, чтобы вы собрали все сфероиды. На этапе промывки убедитесь, что вы не теряете сфероиды при аспирации.

- Чтобы промыть сфероиды в дозе 50 микролитров 1X PBS, центрифугируйте в 1 000 раз g в течение 30-60 секунд, затем осторожно удалите PBS с помощью пипетирования. В зависимости от окрашиваемого белка зафиксируйте сфероиды либо 50 микролитрами 4% параформальдегида в PBS на 20 минут при комнатной температуре.

Промойте сфероиды PBS, как описано ранее. Пермеабилизируйте клетки 0,1% Triton X в PBS в течение 4 минут при комнатной температуре. Затем промыть сфероиды в ПБС трижды, как описано ранее. Добавьте PBS, содержащий 5% FBS и 2% BSA, к сфероидам и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы блокировать неспецифические участки взаимодействия белков.

Теперь инкубируйте сфероиды с 30 микролитрами первичных антител в PBS с 2,5% FBS и 1% BSA при 4 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день промойте сфероиды в PBS три раза, как описано ранее.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 22 августа 2026

Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретическая база

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Значимость для промышленности

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Первичный поиск и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейера и рабочего процесса

Операционное и корпоративное влияние

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Характеристика сфероидов нейроэндокринных опухолей тонкой кишки с помощью иммунофлюоресценции

Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов

Надежный метод крупномасштабного производства сфероидов для скрининга и анализа с высоким содержанием

Быстрая оптическая очистка для полувысокопроизводительного анализа сфероидов опухолей

Культивирование, замораживание, обработка и визуализация целых органоидов и сфероидов еще в гидрогеле