Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

- Сфероиды — это трехмерные модели клеточных культур in vitro. Для иммунофлуоресцентного окрашивания сначала сгенерируют сфероидную культуру нужного типа клеток в многолуночном планшете. С помощью микропипетки с широким наконечником отверстия соберите сфероиды, стараясь не допустить разрыва из-за сил сдвига.

Затем зафиксируйте и пропитайте сфероиды, чтобы сделать отдельные клетки проницаемыми. Теперь инкубируйте с раствором, содержащим белки для блокирования неспецифических участков взаимодействия белков на поверхности клетки. Обработайте сфероиды желаемым коктейлем первичных антител. Инкубируйте антитела, чтобы они связывались с молекулами-мишенями на поверхности клетки.

Затем пометьте сфероиды флуоресцентно меченным раствором вторичного антитела, специфичным для первичных антител. Наконец, обработайте сфероиды подходящим флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, чтобы окрашивать ядра клеток. С помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа можно получить изображение нескольких оптических сечений сфероида в разных оптических плоскостях.

Полученные изображения отражают флуоресцентно меченые ядра и антигены, представляющие интерес. Объедините стеки с помощью соответствую