Экспериментальные модели для изучения пигментного эпителия сетчатки физиологии и патофизиологии

Общая цель данной процедуры заключается в создании культур эпителия сетчатки глаза человека (RPE) из фетальной ткани, которые могут быть использованы в качестве модели. При исследовании заболеваний глаз человека ткани поступают от доноров в виде целых глазных яблок. Первым этапом процедуры является иссечение излишков мышечной и соединительной ткани с последующим вскрытием глаза путем удаления роговицы и хрусталика.

Глаз обрабатывают диспазой и расплющивают, после чего монослой РПЭ отделяют от хориоидеи. Диссекированные клетки РПЭ высевают в флаконы и культивируют в течение нескольких недель до достижения состояния слитного монослоя и появления пигмента. Клеточные культуры используются в функциональных экспериментах in vitro.

Успешные эксперименты in vitro повторяют на моделях животных в ходе доклинических исследований, где ответы РПЭ можно более эффективно оценить в условиях более сложного сигнального окружения. Модель, представленная здесь, позволит лучше понять физиологию РПЭ и разработать новые терапевтические методы лечения глазных болезней. Здравствуйте, меня зовут Шелдон Миллер.

Моя лаборатория находится в Национальном институте зрения, который входит в состав Национальных институтов здравоохранения в кампусе Бетесда, штат Мэриленд. Здравствуйте, меня зовут Арки, я представляю лабораторию Миллера. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру подготовки первичных культур эпителиальных клеток ретинального пигмента плода человека.

Данные клетки будут подготовлены в виде конфлюэнтных монослоев, которые можно поместить в модифицированные камеры Wellman. Мы также будем использовать эти изолированные клетки РПЭ человека для биохимических и генетических исследований. В нашей лаборатории эта процедура применяется для создания первичных культур эпителиальных клеток с целью изучения функций и регуляции физиологических и патофизиологических процессов, а также для разработки клинических моделей заболеваний на животных.

Мы сосредоточим внимание на ретинальном пигментном эпителии (РПЭ), который расположен в задней части глаза и отделяет нейросенсорную сетчатку от кровоснабжения хориоидеи. На этой схеме глаза показано расположение слоя РПЭ в задней части глаза, непосредственно прилегающего к фоторецепторам. На вставке показаны клетки сетчатки: фоторецепторы справа и ганглионарные клетки слева.

Этот эпителий чрезвычайно активен с точки зрения метаболизма. Он непрерывно, ежедневно осуществляет фагоцитоз фоторецепторов, а также запасает, перерабатывает и транспортирует зрительный пигмент витамин А к фоторецепторам. В зрительном цикле он выполняет гомеостатическую функцию, поддерживая химический состав и объем окружающих внеклеточных пространств.

Критически важным свойством эпителия является его полярность. Постоянная асимметричная доставка белков к апикальной и базально-латеральной мембранам представляет собой регулируемый процесс, который позволяет эпителию осуществлять векторный транспорт метаболитов, ионов и жидкости из одного внеклеточного пространства в другое. Эта активность помогает эпителию поддерживать здоровье и целостность нейросенсорной сетчатки.

Описанный здесь метод подготовки in vitro позволяет анализировать транспортные белки, рецепторы и сигнальные пути, определяющие полярность и функцию эпителия, перед началом диссекции. Подготовьте планшет на 12 лунок в ламинарном шкафу, используя растворы комнатной температуры. Для каждого глаза потребуется одна лунка с 10-кратным раствором антибиотика-антимикотика, две лунки с 1-кратным XPBS и одна лунка с раствором, содержащим 2 единицы на миллилитр диска-пространства, разведенного в среде 5% RPE с сывороткой. Наполните диссекционную чашу с силиконовой подложкой 1-кратным раствором H-B-S-S, слейте жидкость и перенесите каждый глаз в отдельную лунку с раствором антибиотика-антимикотика.

Инкубируйте от трех до пяти минут при комнатной температуре. Избегайте чрезмерного давления на глазное яблоко. Промойте глаз в двух последовательных лунках с XPBS, чтобы удалить избыток антибиотика.

Затем с помощью пинцета перенесите его в препаровальную чашку, наполненную одним X-H-B-S-S, под dissecting stereo microscope. С помощью ирисных ножниц удалите излишки мышечной и соединительной ткани вокруг глаза. Расположите глаз так, чтобы роговица была обращена вверх.

Используя две стерильные иглы 27 G, закрепите глаз на силиконовой подложке, зафиксировав его за соединительную ткань, не повреждая склеру. В таком положении с помощью ножа для бокового порта сделайте разрез склеры. Разрез должен располагаться на расстоянии одной трети от экватора глаза до передней поверхности.

Используйте ирисные ножницы, чтобы продолжить круговой разрез вокруг глаза, чтобы избежать повреждения ретинального пигментного эпителия (RPE) из-за притяжения стекловидного тела к сетчатке. С помощью тех же ножниц разрежьте стекловидное тело, чтобы отделить передний лоскут глаза от глазной чаши.

Приподнимите переднюю часть IOA и удалите ее. С помощью пинцета перенесите открытый глаз в лунку с dys. Убедитесь, что в глазном яблоке нет пузырьков воздуха.

Инкубируйте в течение 40–60 минут при 37 °C в атмосфере 5% carbon dioxide. Перенесите глаз из диска обратно в чашку для препарирования, наполненную свежим 1X HBSS комнатной температуры. Расположите глаз чашечкой вверх и зафиксируйте его двумя иглами калибра 27G.

Под диссекционным микроскопом с помощью тонкого пинцета осторожно приподнимите частично отделенную сетчатку и с помощью ретинальных ножниц отсеките ее от зрительного нерва. Удалите сетчатку с помощью ножниц для радужки.

Сделайте разрез от периферии глаза к зрительному нерву. Растяните глаз, зафиксировав его с помощью 5 иголок калибра 27G. Чтобы растянуть слой РПЭ, используйте ретинальные ножницы для выполнения кругового разреза вокруг зрительного нерва.

Отделение слоя РПЭ при переключении на увеличение 250х или более. Найдите край листа РПЭ вдоль разреза, сделанного иридоточными ножницами, рядом с зрительным нервом. Используя два пинцета, отделите РПЭ и мембрану Бруха от слоя хориоидальной ткани.

Проверьте несколько участков вдоль края разреза, чтобы определить место, где связь между РПЭ и хориоидеей наиболее слабая. Осторожно отслойте мембрану, чтобы полностью удалить ее. Поместите листы РПЭ в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, заполненную трипсином в EDTA комнатной температуры.

После сбора всех пластов закройте пробирку крышкой и инкубируйте ее на водяной бане в течение 10 минут при 37 °C. Интенсивно встряхните пробирку, чтобы разделить РПЭ на мелкие кластеры. Отсутствие темных скоплений клеток означает завершение процесса разделения.

Верните пробирку в водяную баню еще на пять минут. С помощью пастерна или пипетки, используя осторожное всасывание, удалите все остатки непереваренной ткани. Центрифугируйте клетки при 280 5G в течение четырех минут.

Удалите супернатант. Доведите конечный объем до девяти миллилитров с помощью среды 15%RPE, используя пипетку, для ресуспендирования. Перенесите пипеткой три миллилитра клеточной суспензии в флакон объемом 25 квадратных сантиметров.

Добавьте два миллилитра свежей культуральной среды 15%RPE комнатной температуры. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide. По мере созревания культур их пигментация будет усиливаться через три-четыре недели.

Успешные культуры будут конфлюэнтными, с однородной и интенсивной пигментацией. Мы только что продемонстрировали вам способ подготовки первичных культур сетчатки (RP) человеческого плода. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.