Анализ образования сфер: метод in vitro для идентификации стволовых клеток рака поджелудочной железы и скрининговой терапии

- Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) содержит подмножество исключительно опухолевых раковых стволовых клеток (CSC). ЦСК являются самообновляющимися, плюрипотентными и способны образовывать опухоли. Они экспрессируют антиапоптотические белки, а также содержат гены с множественной лекарственной устойчивостью, что делает их устойчивыми к химиотерапии. Чтобы выявить раковые стволовые клетки и изучить влияние на них лекарственных препаратов, мы проводим анализ на образование сфер.

Во-первых, суспензируйте извлеченные раковые стволовые клетки в желаемой среде для культивирования клеток. Затем высейте клеточную суспензию в многолуночный планшет и инкубируйте в течение желаемого времени. Добавьте необходимое количество интересующего препарата в несколько лунок и плацебо в другие лунки в качестве отрицательного контроля. Инкубируйте клетки в течение желаемого времени. Раковые стволовые клетки образуют колонии сферической формы в неадгезивной культуральной среде.

После инкубации пипеткой нанесите небольшое количество клеточной суспензии на гемоцитометр и поместите ее в автоматический счетчик клеток. Теперь подсчитайте количество образовавшихся сфер. Клетки, обработанные лекарственными препаратами, обычно демонстрируют существенное уменьшение размера и количества сфер. В следующем протоколе мы выполним анализ формирования сфер для идентификации стволовых клеток рака поджелудочной железы и оценки эффекта метформина.

- Чтобы облегчить образование опухолевой сферы для обогащения раковыми стволовыми клетками, разведите клетки в соответствующем объеме среды раковых стволовых клеток до конечной концентрации от 2 до 10-3 клеток на миллилитр и охладите их на льду в течение нескольких минут. Затем, после добавления 500 микролитров PBS в первый и последний ряды 24 клеточной пластины со сверхнизким прикреплением, ресуспендируйте клетки с помощью пипетки и засейте 1 миллилитр клеток на лунку в пустые лунки планшета.

Обработайте четыре лунки клеток интересующим препаратом и не менее четырех отрицательных контрольных лунок носителем. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение одной недели. Через день добавляйте свежую обработку или средство в каждую из лунок.

На 5 или 7 день оцените количество образовавшихся опухолевых сфер с помощью автоматического счетчика клеток, который позволяет идентифицировать более крупные структуры. Для серийного пассирования опухолевых сфер на 7-й день используйте 40-микрометровый клеточный фильтр для забора сфер. Затем раскрутите шарики вниз и инкубируйте их в 1-миллилитре трипсина в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы диссоциировать гранулу в одноклеточную суспензию. Затем расширяйте ячейки еще на семь дней, как только что было продемонстрировано.