Метод висячей капли: техника получения 3D сфероидов меланомы

- Сфероиды представляют собой трехмерные модели клеточных культур in vitro, которые имитируют архитектуру опухоли in vivo и помогают изучать внутриопухолевые взаимодействия. Чтобы установить культуру, сначала приготовьте одноклеточную суспензию клеток меланомы в соответствующей среде. Затем нанесите небольшие объемы этой клеточной суспензии на внутреннюю поверхность крышки стерильной, неадгезивной формы для культур. Осторожно переверните крышку и поместите ее на основание чашки для культуры, содержащей PBS, чтобы создать камеру гидратации. Инкубируйте тарелку в соответствующих условиях.

Влага из PBS препятствует испарению среды из висящих капель. Освежите капли, заменив несколько микролитров среды. Благодаря поверхностному натяжению капли сохраняют свою сферическую форму и остаются подвешенными к внутренней поверхности пластины. Гравитационные силы позволяют клеткам оставаться во взвешенном состоянии, не распространяясь, но агрегируются с образованием трехмерных сфероидов внутри капель. Наконец, промойте капли PBS, чтобы собрать фероиды. Соберите их в неадгезивную посуду для культуры.

В следующем протоколе мы продемонстрируем генерацию трехмерных сфероидов клеток меланомы 451-LU методом висячей капли.

- Для начала культивируют клетки меланомы 451-LU с использованием среды RPMI, содержащей 10% FCS, в соответствии с общими протоколами культивирования клеток. Чтобы получить сфероиды меланомы, промойте культивируемые клетки меланомы в PBS. Затем добавьте 5 миллилитров 1x Trypsin-EDTA в PBS. Выдерживать от 3 до 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 5 миллилитров RPMI, содержащего 10% FCS, чтобы нейтрализовать трипсин. Затем перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут, чтобы собрать клетки. Ресуспендируйте клеточную гранулу в RPMI, содержащем 10% FCS.

Далее подсчитайте клетки и разведите клеточную суспензию до конечной концентрации 10 000 клеток на миллилитр. С помощью электронной мультипипетки сделайте 40 x 25 микролитров пятен клеточной суспензии на внутренней поверхности крышки стерильной, неадгезивной 10-сантиметровой чашки для клеточных культур.

Затем быстрым, плавным движением переверните крышку и поместите ее на чашку для клеточной культуры, содержащую 5 миллилитров PBS. Заквашивайте подвешенные капли при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение 10-14 дней.

Через пять дней после появления кровянистых выделений с помощью электронного дозатора добавьте 10 микролитров RPMI, содержащих 10% FCS, в каждую каплю. Через 10-15 дней соберите урожай с фероидов, аккуратно смыв их с крышки PBS. Соберите сфероиды в свежую неадгезивную чашку для клеточных культур.