Выделение кератиноцитов кожи человека: метод культивирования первичных кератиноцитов из образцов кожи

- Кератиноциты — это наиболее заметные клетки, присутствующие в эпидермисе или самом внешнем слое кожи. Они располагаются несколькими слоями по дерме, связанными с различными другими типами клеток, такими как меланоциты, дендритные клетки и клетки Меркеля.

Чтобы выделить кератиноциты, начните со забора эпидермальной ткани с кожи человека. Далее обработайте ферментативным буфером для пищеварения. Ферменты в буфере разрушают белки внеклеточного матрикса, присутствующие в эпидермальной ткани, тем самым инициируя диссоциацию клеток. Теперь добавьте подходящую среду и механически разрушьте ткань.

Чтобы высвободить диссоциированные клетки в суспензию, отфильтруйте суспензию эпидермальных клеток через ситечко, чтобы удалить любые клеточные скопления или мусор. Центрифуга для гранулирования клеток эпидермиса и отделения их от надосадочной жидкости, содержащей фермент. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки, используя предпочтительную среду для роста кератиноцитов. Культивируйте клетки в течение желаемого времени.

Во время культивирования оптимизированные среды обогащают экспансию кератиноцитов, способствуя их избирательному росту по сравнению с другими типами эпидермальных клеток. В следующем протоколе мы покажем выделение кератиноцитов из тканей кожи взрослого человека.

- Соберите образцы кожи размером 10 на 15 сантиметров у здоровых взрослых добровольцев, перенесших пластическую операцию. Поддерживайте прохладу кожи, транспортируя образцы кожи в коробке из пенополистирола, содержащей охлаждающий элемент. При необходимости храните образец кожи при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи. С помощью стерилизованных ножниц, скальпелей и щипцов удалите жир из-под участка кожи.

Затем с помощью игл застегните участок кожи на стерильной крышке поверх тарелки. С помощью сухого, стерилизованного марлевого салфетки очистите кожу. Затем нанесите 70% этанол на стерилизованный марлевый тампон. Далее, с помощью рубанка для ног, срежьте верхний эпидермальный слой участка кожи, и перенесите его в 9-сантиметровую чашку Петри.

Затем сразу же добавьте в чашку Петри 25 миллилитров ранее приготовленного раствора DPBS/трипсина/глюкозы. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. С помощью пипетки удалите раствор DPBS/трипсина/глюкозы из чашки Петри и добавьте 10 миллилитров RPMI-1640 плюс 2% FBS для инактивации трипсина.

Теперь с помощью двух щипцов высвободите клетки эпидермиса в среду, осторожно соскребая и взбалтывая как эпидермальный, так и дермальный отсеки участков кожи. Отфильтруйте суспензию эпидермальных клеток через металлический фильтр и соберите фильтрат в пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте оставшиеся участки кожи в 50 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров RPMI-1640 без FBS и вихря на 10 секунд.

Отфильтруйте эту суспензию через металлический фильтр в 50-миллилитровую пробирку, содержащую суспензию эпидермальных клеток. Затем добавьте DPBS до общего объема 50 миллилитров. Центрифугируйте клеточную суспензию при 450 х г при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и, в зависимости от размера клеточной гранулы, ресуспендируйте эпидермальную клеточную гранулу примерно в 10 миллилитрах 37 градусов Цельсия KSFM.

Используя метод окрашивания Trypan Blue, подсчитайте клетки под микроскопом. Затем в каждую культуральную колбу площадью 75 квадратных сантиметров перенесите 8 раз по 10 в шестую ячейки вместе с 12 миллилитрами 37 градусов Цельсия КСФМ. Осторожно встряхивайте колбы с культурой, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте кератиноциты в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия при 100% влажности и 5%_CO2. Меняйте среду через два дня, а затем, 3 раза еженедельно.