Выделение стволовых клеток меланомы: метод получения CD133-положительных и отрицательных клеток меланомы с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток

- Меланома содержит небольшую субпопуляцию раковых стволовых клеток, обладающих как способностью к самообновлению, так и к инициации опухоли. CD133 или Проминин-1, пентаспановый трансмембранный гликопротеин, является одним из ключевых маркеров, экспрессируемых стволовыми клетками метастатической меланомы. Чтобы выделить CD133-положительные клетки, начните с суспензии первичных клеток меланомы в соответствующем буфере.

Инкубируйте с блокирующим реагентом, содержащим белки, которые блокируют неспецифические участки связывания на поверхности клетки. Обработайте клетки биотинилированными первичными антителами к CD133. Эти антитела связываются с антигенами CD133, экспрессируемыми на CD133-положительных клетках. Теперь добавьте в суспензию антибиотиновые магнитные микрогранулы. Инкубируйте микрогранулы, чтобы они связывались с клетками, меченными биотином.

Наконец, пропустите инкубированную суспензию через колонку, помещенную в магнитное поле. При магнитном воздействии все меченые микрошариками CD133-положительные клетки прилипают к колонке, в то время как немеченые клетки проходят сквозь нее. Соберите эти немеченые CD133-отрицательные клетки. Извлеките колонку из магнитного поля. Промойте содержимое с помощью подходящего буфера для элюирования и сбора CD133-положительных клеток.

В следующем протоколе мы покажем выделение CD133-положительных и отрицательных раковых стволовых клеток из культуры первичной меланомы, полученной из опухолевой ткани. Промойте 80% сливающиеся клетки с предварительно подогретым PBS. Добавьте соответствующее количество Аккутазы и инкубируйте до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности культуры. Соберите клетки в среде Quantum 263 и переложите в 50-миллилитровую пробирку.

Перечислите ячейки. Затем центрифугируйте необходимое количество клеток в течение 5 минут при температуре 300 x g и температуре от 4 до 8 градусов Цельсия. Отсасывайте надосадочную жидкость полностью, и ресуспендируйте до 1 раза по 10 до восьмой клетки в 350 мкл буфера MACS. Добавьте 100 микролитров блокирующего реагента FcR и 50 микролитров CD133/1-биотина. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут.

Промойте клетки 10 миллилитровым буфером MACS, после чего центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g и температуре от 4 до 8 градусов Цельсия. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость. После повторной промывки повторно суспендируйте клеточную гранулу в 400 микролитрах буфера MACS. Добавьте 100 микролитров микрогранул антибиотина и хорошо перемешайте. Выдерживайте при температуре от 4 до 8 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Тем временем, чтобы подготовить сепаратор MACS к магнитной сепарации, прикрепите QuadroMACS к многостендовому сепаратору MACS. Вставьте необходимое количество колонн LS с крыльями колонны вперед в магнитное поле QuadroMACS. Поместите фильтр предварительной сепарации в каждую колонну LS и соответствующую сборную трубку под каждой колонкой.

Промойте фильтр и колонку буфером MACS объемом 3 миллилитра и удалите поток. После промывки клеток в буфере MACS, как описано ранее, повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера MACS и нанесите клеточную суспензию на подготовленную колонку LS. Промойте три раза 3 миллилитрами буфера MACS на колонку. Соберите общий объем сточных вод немеченой CD133-отрицательной клеточной фракции.

Затем выбросьте фильтр предварительной сепарации, снимите колонку с сепаратора и поместите ее на подходящую сборную трубку. Нанесите 5 миллилитров буфера MACS. Немедленно промойте меченые CD133-положительные клетки, сильно вдавливая поршень в колонку. Чтобы повысить чистоту отрицательной фракции, нанесите клеточную суспензию на новую уравновешенную колонну LS и соберите отходящую CD133-отрицательную фракцию.