Почему выделение CD133-положительных клеток имеет значение для валидации мишеней при меланоме?

Изоляция CD133-положительных клеток позволяет функционально протестировать способность к туморогенезу и самообновлению, что имеет решающее значение для валидации мишеней раковых стволовых клеток при меланоме. Такая очистка снижает влияние нестволовых клеток, повышая достоверность анализов зависимости от мишени. Данный метод способствует механистическому снижению рисков путем установления связи между экспрессией CD133 и потенциалом инициации опухоли.

Как магнитная сепарация клеток позволяет изолировать независимые переменные в исследованиях стволовых клеток?

Магнитная сепарация клеток позволяет выделить CD133-положительные и CD133-отрицательные фракции путем маркировки только целевой популяции биотинилированными антителами и микросферами, что позволяет сформировать четко определенные экспериментальные группы. Такая изоляция независимой переменной (статуса CD133) позволяет исследователям однозначно связать функциональные различия с обогащением культуры стволовыми клетками. Данный метод гарантирует, что наблюдаемые в анализах фенотипы связаны с изолированной переменной, а не с присутствием смешанных популяций.

Какие количественные измерения зависимых переменных становятся возможными при выделении фракций меланомы, определяемых по маркеру CD133?

Изолированные фракции позволяют проводить количественные измерения, такие как эффективность формирования сфер, частота инициации опухолей in vivo и показатели дифференциального ответа на лекарственные препараты. Эти зависимые переменные обеспечивают получение числовых данных для сравнения фенотипов, связанных со стволовыми свойствами, между CD133-положительными и отрицательными клетками. Данный метод позволяет проводить статистический анализ частоты появления стволовых клеток и их функциональной активности при различных экспериментальных условиях.

Почему требования к репликации имеют значение для выделения надежных CD133-положительных и отрицательных клеток меланомы?

Репликация гарантирует, что изоляция обеспечивает стабильную чистоту и жизнеспособность фракций, определенных по маркеру CD133, в разных экспериментах, что крайне важно для воспроизводимости функциональных анализов. Вариабельность эффективности разделения может исказить сравнение между стволовыми и нестволовыми популяциями, что подорвет усилия по валидации мишеней. Стандартизированные протоколы с повторными прогонами помогают установить надежные пороги чистоты и выхода в промышленных условиях.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением выделения CD133 в рабочие процессы по изучению стволовых клеток меланомы?

Для реализации метода требуется возможность количественного определения чистоты и выхода с помощью проточной цитометрии или аналогичных методов для оценки эффективности разделения. Статистическое сравнение результатов функциональных тестов (например, образования опухоли, пролиферации) между изолированными фракциями требует инструментов для расчета значимости и величины эффекта. Доступ к программному обеспечению для анализа данных повторов гарантирует, что наблюдаемые различия в фенотипах стволовых клеток являются статистически достоверными и не обусловлены вариабельностью процесса изоляции.

Выделение стволовых клеток меланомы: метод получения CD133-положительных и отрицательных клеток меланомы с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 5:40 мин • April 30th, 2023

- Меланома содержит небольшую субпопуляцию раковых стволовых клеток, обладающих как способностью к самообновлению, так и к инициации опухоли. CD133 или Проминин-1, пентаспановый трансмембранный гликопротеин, является одним из ключевых маркеров, экспрессируемых стволовыми клетками метастатической меланомы. Чтобы выделить CD133-положительные клетки, начните с суспензии первичных клеток меланомы в соответствующем буфере.

Инкубируйте с блокирующим реагентом, содержащим белки, которые блокируют неспецифические участки связывания на поверхности клетки. Обработайте клетки биотинилированными первичными антителами к CD133. Эти антитела связываются с антигенами CD133, экспрессируемыми на CD133-положительных клетках. Теперь добавьте в суспензию антибиотиновые магнитные микрогранулы. Инкубируйте микрогранулы, чтобы они связывались с клетками, меченными биотином.

Наконец, пропустите инкубированную суспензию через колонку, помещенную в магнитное поле. При магнитном воздействии все меченые микрошариками CD133-положительные клетки прилипают к колонке, в то время как немеченые клетки проходят сквозь нее. Соберите эти немеченые CD133-отрицательные клетки. Извлеките колонку из магнитного поля. Промойте содержимое с помощью подходящего буфера для элюирования и сбора CD133-положительных клеток.

В следующем протоколе мы покажем выделение CD133-положительных и отрицательных раковых стволовых клеток из культуры первичной меланомы, полученной из опухолевой ткани. Промойте 80% сливающиеся клетки с предварительно подогретым PBS. Добавьте соответствующее количество Аккутазы и инкубируйте до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности культуры. Соберите клетки в среде Quantum 263 и переложите в 50-миллилитровую пробирку.

Перечислите ячейки. Затем центрифугируйте необходимое количество клеток в течение 5 минут при температуре 300 x g и температуре от 4 до 8 градусов Цельсия. Отсасывайте надосадочную жидкость полностью, и ресуспендируйте до 1 раза по 10 до восьмой клетки в 350 мкл буфера MACS. Добавьте 100 микролитров блокирующего реагента FcR и 50 микролитров CD133/1-биотина. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут.

Промойте клетки 10 миллилитровым буфером MACS, после чего центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g и температуре от 4 до 8 градусов Цельсия. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость. После повторной промывки повторно суспендируйте клеточную гранулу в 400 микролитрах буфера MACS. Добавьте 100 микролитров микрогранул антибиотина и хорошо перемешайте. Выдерживайте при температуре от 4 до 8 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Тем временем, чтобы подготовить сепаратор MACS к магнитной сепарации, прикрепите QuadroMACS к многостендовому сепаратору MACS. Вставьте необходимое количество колонн LS с крыльями колонны вперед в магнитное поле QuadroMACS. Поместите фильтр предварительной сепарации в каждую колонну LS и соответствующую сборную трубку под каждой колонкой.

Промойте фильтр и колонку буфером MACS объемом 3 миллилитра и удалите поток. После промывки клеток в буфере MACS, как описано ранее, повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера MACS и нанесите клеточную суспензию на подготовленную колонку LS. Промойте три раза 3 миллилитрами буфера MACS на колонку. Соберите общий объем сточных вод немеченой CD133-отрицательной клеточной фракции.

Затем выбросьте фильтр предварительной сепарации, снимите колонку с сепаратора и поместите ее на подходящую сборную трубку. Нанесите 5 миллилитров буфера MACS. Немедленно промойте меченые CD133-положительные клетки, сильно вдавливая поршень в колонку. Чтобы повысить чистоту отрицательной фракции, нанесите клеточную суспензию на новую уравновешенную колонну LS и соберите отходящую CD133-отрицательную фракцию.