Быстрое культивирование первичных меланоцитов и фибробластов мыши: выделение меланоцитов и фибробластов из цельного образца кожи мыши

- Кожа состоит из различных клеток, населяющих ее различные слои. Меланоциты, клетки, продуцирующие меланин, локализуются в эпидермально-дермальном соединении, в то время как фибробласты, клетки, генерирующие соединительную ткань, находятся в дерме.

Чтобы быстро выделить меланоциты и фибробласты, начните с забора туловища усыпленного щенка мыши. Разрежьте кожуру вентрально по всей длине ствола. Отшелушите кожу, содержащую эпидермальный и дермальный слой, и измельчите ткань на мелкие кусочки.

Теперь лечите с помощью буфера для пищеварения, содержащего ферменты трипсин и коллагеназу, которые разрушают внеклеточный матрикс, высвобождая клетки в суспензию. Центрифуга для гранулирования клеток и выброса надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте клетки в меланоцитарной среде и перенесите суспензию в многолуночный планшет.

Во время культивирования большая часть фибробластов прилипает к дну лунки, в то время как меланоциты и другие эпидермальные клетки остаются во взвешенном состоянии. Аспирируйте взвешенные клетки и добавьте в культуру фибробластов специфичные для фибробластов среды, чтобы стимулировать их рост. Перенесите аспирированную суспензию в свежую лунку, покрытую коллагеном, чтобы способствовать формированию адгезивной культуры.

Добавьте генетин, антибиотик, и добавьте свежую среду для роста меланоцитов. Генетин избирательно устраняет любые оставшиеся фибробласты, в то время как среда способствует росту меланоцитов по сравнению с другими типами эпидермальных клеток. В следующем протоколе мы изолируем меланоциты и фибробласты из кожи мышиного щенка.

- В ламинарном шкафу кратко сверните туловище каждой усыпленной мыши в стерильную чашку Петри, содержащую 70% этанола. Извлеките мышь из этанола и поместите ее в пустую стерильную чашку Петри. Далее простерилизуйте хирургические ножницы в 70% этаноле. С помощью этих ножниц сделайте надрез на коже на брюшной стороне туловища, начиная от шеи и продолжая до хвоста. С помощью стерильных щипцов отшелушите кожу от туловища мыши и удалите излишки жировой ткани с дермальной стороны кожи.

Поместите кожу дермой вниз в 6-луночную чашку, содержащую 3 миллилитра 1x раствора антибиотика/антимикотика. Выдерживать при комнатной температуре от 2 до 3 минут. Затем включите измельчитель тканей и отрегулируйте настройки в соответствии с показанными здесь.

- Обязательно соблюдайте осторожность при установке лезвия измельчителя тканей и при работе с машиной.

- Перенесите кожу дермой вниз в чашку для измельчителя стерильных тканей и трижды полностью пропустите кожу через измельчитель тканей. После этого перенесите гомогенизированную кожу в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую 3 миллилитра буфера для пищеварения кожи.

С помощью микропипетки P1000 перемешайте полученную суспензию, энергично пипетируя вверх и вниз от десяти до пятнадцати раз. Закройте коническую пробирку крышкой и инкубируйте образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, переворачивая пробирку каждые 3-5 минут.

Затем центрифугируйте пробирку в качающемся роторе ведра при температуре 750 x g при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки в гомогенате кожи. Используйте микропипетку P1000, чтобы медленно и полностью удалить буфер пищеварения кожи, стараясь не повредить гранулы.

- Обязательно отсасывайте весь буфер для переваривания кожи. Если у вас возникли проблемы, промойте клеточную гранулу 2–3 миллилитрами меланоцитарной среды и повторите центрифугирование и удалите излишки буфера для переваривания кожи.

- Затем тщательно ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 миллилитр меланоцитарной среды, пипетируя вверх и вниз пятнадцать-двадцать раз с помощью пипетки P1000. Полученный клеточный раствор переложите по каплям в лунку без покрытия в 6-луночной чашке, содержащей 1 миллилитр меланоцитарной среды. Инкубировать покрытый гомогенат кожи в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 40 минут.

После этого перенесите надосадочную жидкость культуры из непокрытой чашки в одну лунку предварительно промытой 6-луночной чашки, покрытой коллагеном. Добавьте G418 в среду так, чтобы конечная концентрация составила 100 нанограмм на миллилитр. Добавьте 2 миллилитра фибробластной среды в одну лунку непокрытой посуды, теперь содержащей адгезивные фибробласты. Инкубируйте обе культуры в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

После 16-24 часов инкубации отдельно отсасывайте среду и любой мусор из каждой культуры. Вымойте каждую посуду дважды, используя 1 миллилитр PBS для каждого мытья. Затем добавьте 2 миллилитра свежей среды меланоцитов в культуру меланоцитов и добавьте 2 миллилитра свежей среды фибробластов в культуру фибробластов.