Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Направленной дифференцировки ЭСК в специфические клетки вызвал большой интерес в регенеративной медицине. Мы предоставляем краткие, шаг за шагом протокол для определения

Общая цель этой процедуры заключается в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека in vivo и определении их тканеспецифической судьбы. Это достигается путем создания гранулы из генетически помеченных клеток, представляющих интерес. Вторым этапом процедуры является хирургическое помещение гранулы под капсулу почки мыши с ослабленным иммунитетом.

Третий шаг процедуры заключается в том, чтобы позволить клеточной грануле дифференцироваться в течение 8-12 недель под капсулой почки мыши. Заключительным этапом процедуры является забор полученной тератомы, фиксация ее формалина и анализ судьбы меченых клеток с помощью иммуногистохимии. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают, что меченые клетки развиваются в один или несколько из трех зародышевых слоев посредством гистологии и иммуногистохимии полученных тератом.

Здравствуйте, я Карисса Ритнер из лаборатории доктора Гарольда Бернштейна в Институте сердечно-сосудистых исследований Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Сегодня мы покажем вам процедуру развития тератомы с помощью приживления капсулы почки. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, чтобы гарантировать, что каждая линия, с которой мы работаем, может развиваться в каждый из трех зародышевых слоев, и привлечь судьбу генетически помеченных стволовых клеток in vivo.

Все процедуры, которые мы вам покажем, выполняются с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в учреждениях UCSF. Кроме того, вся работа с человеческими эмбриональными стволовыми клетками выполняется с одобрения Комитета по надзору за исследованиями стволовых клеток UCSF. Итак, приступим.

Для получения культур эмбриональных стволовых клеток человека обратитесь к текстовой части данного протокола. Для заметок в капюшоне для ламины, обработайте ингибитором камня обработанные культуры эмбриональных стволовых клеток человека одним миллиграмм на миллилитр коллагеназы четыре инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа аспирировать коллагеназу четыре из, скважины. Замените его одним миллилитром DPBS комнатной температуры с добавлением 10% пенициллина стрептомицина.

С помощью клеточного подъемника с плоской головкой соскребите колонии с планшета и перенесите 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую из двух микроцентрифужных пробирок. Промойте лунку одним миллилитром DPBS и перенесите 0,5 миллилитра ополаскивателя на каждый импульс трубки. Вращайте трубки в течение 20 секунд с 8 000-кратным действием тяжести, аспирируйте супинат и ресуспендируйте каждую гранулу в 500 микролитрах свежего DPBS в концентрации 100 микролитров одного миллиграмм на миллилитр.

Fasi vulgaris lectin в DPBS в каждую пробирку, чтобы помочь связать клетки вместе для трансплантации. Инкубируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение пяти минут. Вращайте ячейки со скоростью, в 8 000 раз превышающей силу тяжести, в течение двух минут, чтобы выровнять гранулу.

Поверните трубки на 180 градусов в их роторных углублениях. Затем снова вращайте по 8 000 раз. Действуйте гравитационно в течение двух минут.

Осторожно аспирируйте назин SUP, оставляя гранулы нетронутыми, чтобы выбить гранулы из трубки. Аккуратно нанесите пипеткой 200 микролитров среды KSR рядом с краем гранулы, пока она медленно не поднимется вверх. Как только гранула будет вытеснена, немедленно втяните среду в ячейку с толщиной 0,4 микрометра.

Вставьте в лунку три миллилитра KSR. Терпимая. Выдерживайте в течение двух часов до ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Поместите обезболенную иммунодефицитную мышь на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение.

С помощью операционных ножниц и щипцов для радужной оболочки глаза сделайте разрез длиной 2,5 сантиметра через кожу параллельно позвоночнику. Но только не по центру. Сделайте меньший разрез через мышцу чуть ниже ребер и примерно в одном сантиметре от позвоночника.

Разрез должен быть достаточно большим, чтобы протянуть почку через нее, но достаточно маленьким, чтобы почка не соскользнула обратно в брюшную полость без силы. С помощью пипетки для макарон, которая была вытянута в форму тупого крючка, аккуратно протяните почку через разрез мышцы. Периодически смачивайте почку стерильным DPBS, чтобы предотвратить пересыхание хрупкой капсулы с помощью тонких щипцов.

Аккуратно потяните капсулу в сторону от почки. С помощью весенних ножниц Venice Spring Scissors сделайте двухмиллиметровый разрез в капсуле. В центр почки вставьте пипетку для пасты, которая была протянута к очень тонкому затупленному зонду между капсулой в почке, и осторожно покачивайтесь, чтобы сделать небольшой карман, повторите это с другой стороны почки, чтобы осталось два кармана.

По одному на каждом полюсе почки. Использование наконечника для пипетки большого диаметра на одноразовом переносе. Пипетка поднимает одну гранулу из вставки миллиячейки.

Берите как можно меньше среды, так как избыток среды может помешать переносу гранул. С помощью щипцов удерживайте край кармана на почке. Аккуратно поместите гранулу рядом с отверстием и с помощью вытянутого зонда пипетки протолкните ее в карман к одному полюсу почки.

Поместите вторую гранулу в карман по направлению к противоположному полюсу. Осторожно поместите капсулу обратно вниз на гранулы. Для закрытия капсулы не нужно накладывать швы.

С помощью пипетки с крючком аккуратно протолкните почку обратно в брюшную полость. Разрез мышцы должен быть достаточно маленьким, чтобы его можно было закрыть одним шелковым швом. Закройте кожу серией из четырех-пяти прерывистых швов и дайте животному восстановиться после операции, прежде чем вернуть его в помещение для животных через восемь-двенадцать недель после операции.

Удалите тератому почки и любые окружающие кисты из брюшной полости в виде блока ткани. Поместите весь блок акцизной ткани в полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 10% буферизованной смеси. Дайте тератоме закрепиться при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

Извлеките тератому из трубки и положите ее на коврик. Используйте скальпель, чтобы удалить любые кисты и как можно больше почек, не повреждая саму тератому. Более крупные тератомы могут быть разрезаны пополам для облегчения рассечения и внедрения.

Обработайте тератому с помощью стандартного метода фиксации парафина и запачкайте срезы на предметных стеклах для анализа и визуализации. Для получения подробной информации обратитесь к примечаниям в текстовой части протокола. Здесь мы покажем вам срезы тканей типичной тератомы.

Эта тератома была окрашена гематом и эоином для идентификации эмбриональных тканей, представляющих все три зародышевых слоя и показывающих зарождающуюся структуру нервной трубки, репрезентативную для векторной дермы. В этом разделе представлен еще один пример векторной дермы, в данном случае примитивного плоского эпителия. Здесь хрящ, окруженный капсулой из конденсированной мезенхимы, представляет собой ткани, полученные из эмбриональной мезодермы.

Наконец, на этом срезе, показывающем структуру железистого кишечника, демонстрируется конечная дермальная ткань внутри тератомы, чтобы составить карту судьбы генетически меченых стволовых клеток, тератомы были засеяны смесью дикого типа и CD 1 33 положительных человеческих эмбриональных стволовых клеток. CD 1 33 положительные производные клетки, обозначенные стрелками, наблюдались в тканях, происходящих из эмбрионального хедера, в частности, в нейроэпителии и зарождающихся структурах, похожих на нервные трубки. Я доктор Гарольд Бернштейн.

Карисса только что показала вам, как формировать тератомы из культур эмбриональных стволовых клеток человека для проведения анализа развития in vivo. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости быть осторожным с клетками и следить за техникой асептики. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.