Primer-Свободное выделение аптамер Использование случайных библиотеки ДНК

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации аберов из рандомизированной библиотеки, которые специфически связываются с целевым белком, в данном случае — белком S 100 B. Это достигается путем первоначального переваривания библиотеки рестрикционной эндонуклеазой для высвобождения случайных последовательностей из фланкирующих фиксированных праймерных последовательностей. Вторым этапом процедуры является связывание случайных последовательностей библиотеки с очищенным белком S 100 B и их последующее выделение.

Третьим этапом процедуры является воссоединение связанных последовательностей с фиксированными последовательностями праймеров путем гибридизации и лигирования. Заключительным этапом процедуры является транскрипция продуктов лигирования для последующей реамплификации пула связанных кандидатных aber с помощью R-T-P-C-R, после чего следуют дополнительные раунды данной процедуры селекции. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие специфическое связывание отобранных aber с белком S 100 B.

Например, здесь анализы с использованием сэндвич-связывания проводятся с помощью микрочипов, а анализы с использованием флуоресцентно-меченных вторичных антител проводятся с помощью функционализированных нанопроволок и вторичных антител, сопряженных с золотыми наночастицами размером 15 nanometer. Сегодня мы продемонстрируем процедуру отбора оптимальных антител, которые связываются с белком S100B, из случайной библиотеки последовательностей. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для различных целей, включая разработку сенсорной платформы для ранней диагностики рака.

Приступим к выполнению. Для начала данной процедуры создайте библиотеку ДНК без праймеров (PF-библиотеку), как было описано ранее. Расщепление двухцепочечной библиотеки ДНК с последующей очисткой с помощью 10% денатурирующего полиакриламидного геля позволит получить фрагмент из 32 нуклеотидов с 5'-фосфатом и фрагмент из 30 нуклеотидов с 5'-фосфатом, обозначенные соответственно как фрагменты 32+ и 30+.

Фрагмент 32+ содержит рандомизированный домен из 30 нуклеотидов с минимальной фланкирующей последовательностью CC на 3'-конце, в то время как фрагмент 30+ состоит только из последовательности рандомизированного домена из 30 нуклеотидов. Чтобы подготовить ДНК-фрагменты библиотеки PF для селекции aptr, ресуспендируйте каждый из фрагментов 32+ и 30+ в 40 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.4. Затем нагрейте образцы при 85 °C в течение трех минут после инкубации.

Охлаждайте образцы в течение трех минут в водяной бане-инкубаторе при 37 °C, затем добавьте 760 µL селекционного буфера и инкубируйте в течение трех минут при 37 °C. По истечении трех минут выдержите образец при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации пропустите раствор через колонку с агарозными бусинами Ni-NTA, предварительно промытыми селекционным буфером.

Для удаления неспецифической ДНК соберите фрагменты ДНК библиотеки PF, которые не связались с колонкой, и отложите их для дальнейшего использования. Для подготовки связанных бусин S 100 B сначала центрифугируйте 400 µL никелевых бусин NDA в течение трех секунд в микроцентрифуге и удалите супернатант. Затем промойте бусины 400 µL связывающего буфера, осторожно пропипетировав содержимое пять раз.

Затем центрифугируйте гранулы и удалите супернатант. Повторите эту процедуру. Промойте дважды.

Затем перенесите ранее очищенный белок с гистидиновым тегом на сорбент. В данном случае используется человеческий кальций-связывающий белок S100B. Осторожно перемешивайте раствор, прокачивая его через пипетку вверх-вниз пять раз каждые три минуты в течение 15 минут.

Через 15 минут центрифугируйте бусины и удалите супернатант. Наконец, промойте связанные с бусинами S 100 B 400 мкл селекционного буфера, осторожно перемешивая их вверх-вниз три раза. Снова центрифугируйте бусины и удалите супернатант.

Повторите этот этап дважды, чтобы в общей сложности провести три финальных промывки для селекции абберов, связавшихся с S 100 B. Возьмите фрагменты 32 плюс и 30 плюс, которые были отложены ранее. Добавьте фрагменты к S 100 B, связанному с бусинами. Затем инкубируйте образец в течение 15 минут.

После 15 минут перемешивания каждые три минуты путем осторожного пипетирования вверх-вниз, кратко центрифугируйте бусины, удалите супернатант, затем промойте комплекс S 100 BDNA 800 microliters селекционного буфера, осторожно используя пипетку. Затем снова центрифугируйте бусины и удалите супернатант. Повторите этот этап промывки дважды.

Для выделения S 100 к гранулам добавьте 200 µL 20 мМ Tris-HCl (pH 7,4). Затем нагрейте суспензию в течение трех минут при 85 °C. После инкубации.

Перемешивайте гранулы на вортексе в течение одной минуты, затем центрифугируйте их для осаждения. Перенесите супернатант в новую пробирку. Повторите этот шаг еще раз и объедините полученные супернатанты.

Наконец, очистите выбранные фрагменты ДНК. Экстрагируйте продукты ПЦР дважды эквивалентным объемом фенилхлороформа и изопропилового спирта. Осадите их с помощью 250 millimolar хлорида натрия и 2,5 объемами 100% Ethanol при температуре minus 70 °C в течение 15 минут.

Центрифугируйте при 21 000 GS при температуре четырех градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем удалите супернатант. Тщательно промойте осадок 75% этанолом.

Центрифугируйте при 21,000 GS при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут и удалите супернатант. Высушите осадок в вакуум-концентраторе в течение трех минут после 10 раундов селекции. Клонируйте полученные ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК в вектор pCR 2.1 topo, полученный из vitrogen core.

Затем проведите секвенирование от 40 до 50 отдельных колоний для каждого из выбранных фрагментов N 30 cc и N 30 с использованием прямого праймера M 13. Выровняйте выбранные последовательности с помощью программного обеспечения infomax vector NTI. Затем определите консенсусные последовательности на основе полученных выравниваний.

После идентификации консенсусных последовательностей приобретите консенсусные олигонуклеотиды, как описано в письменном протоколе. Приведите первый синтезированный аптамер с 5'-амино-C6-группой в буфере для печати до конечной концентрации 15 micromolar. Затем нанесите раствор аптамера на слайды, активированные CodeLink, используя микроматрицу Apogen Discoveries.

Следуйте протоколам, рекомендованным по ссылке в коде. Распечатайте каждый слайд с 12 массивами. Используйте формат два на восемь.

Кассета для гибридизации микрочипа. Разведите белок S 100 B до соответствующей концентрации в 70 µL PBS. Затем внесите раствор в лунки кассеты микрочипа.

Герметично закройте кассету микрочипа, используя безнуклеазную адгезивную алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить испарение. Оставьте белок для связывания с антителами, нанесенными на код-линк. После инкубации выдержите в течение одного часа при комнатной температуре.

Трижды промойте лунки кассеты PBS с 5 мМ хлорида магния или PBSM. Затем разведите флуоресцентно меченные вторичные антитела до концентрации 0,125 мкМ в 70 мкл PBSM. Нагревайте смесь в течение трех минут при 85 °C.

Затем дайте меченым ABERS охладиться на льду. В течение трех минут нанесите ABERS в лунки кассеты микрочипа. Снова герметично закройте кассету адгезивной фольгой и инкубируйте их в течение одного часа при комнатной температуре.

Снова повторите процедуру индивидуально. После промывки трижды промойте лунки раствором PBSM. Разберите кассету и промойте весь предметное стекло раствором PBSM.

Затем тщательно высушите предметное стекло путем центрифугирования. В завершение просканируйте стекло с помощью сканирующего массива Packard Biosciences. Связывание 4 000 XL было определено для аптамеров с меткой $\gamma$ P 32 ATP на 5'-конце по отношению к белку S 100 B и отложено в зависимости от концентрации для определения KD.

Репрезентативные значения Kd после приблизительно семи раундов селекции обычно находятся в диапазоне 10⁻⁷ М. Аптамеры первого ряда с 5'-концевым направляющим фрагментом были иммобилизованы на микрочипах CodeLink. Очищенный белок S 100 B связывали с первым аптамером, после чего к комплексам первого аптамера с S 100 B присоединяли второй аптамер, меченный LOR 546.

Количественное определение флуоресценции проводили с помощью сканирующего массивного сканера. На среднем ряду показано сэндвич-связывание, характеризующееся аддитивным связыванием в анализах KD в рядах выше и ниже. Сэндвич-связывание для abers отсутствует; первые abers с тиолированной модификацией на 5'-конце были присоединены к золотым нанопроволокам с использованием стандартной тиольной химии.

Вторые аптамеры были сопряжены с 50 нм NMO или золотыми наночастицами аналогичным образом. Затем очищенный белок S 100 B связывали сначала с модифицированными нанопроволоками, после чего к комплексам нанопроволок с первым аптамером и белком S 100 B присоединяли 50 нМ золотых наночастиц со вторым аптамером. Связанные сэндвич-комплексы визуализировали с помощью FE SEM.

Отрицательный контроль можно увидеть для анализа связывания, проведенного с белком HTRA one вместо белка S 100 B. Итак, одним из наиболее важных аспектов процедуры является использование подхода без праймеров, при котором отсутствуют фиксированные последовательности, способные вызвать ложноположительные и ложноотрицательные результаты из-за того, что сами последовательности подавляют случайный регион. При выполнении данной процедуры важно убедиться, что матрица ДНК разрушена перед каждой реакцией обратной транскрипции, а также тщательно изолировать специфический продукт R-T-P-C-R после каждого этапа реамплификации.

На этом всё. Спасибо за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.