Primer-Свободное выделение аптамер Использование случайных библиотеки ДНК

Общей целью этой процедуры является идентификация аберов из случайной библиотеки, которые специфически связываются с белком-мишенью, в данном случае, белком S 100 B. Это достигается путем предварительного расщепления библиотеки эндонуклеазой рестрикции для высвобождения случайных последовательностей от фланкирующих фиксированных последовательностей праймеров. Вторым этапом процедуры является связывание случайных библиотечных последовательностей с очищенным белком S 100 B и их восстановление.

Третьим этапом процедуры является воссоединение связанных последовательностей с фиксированными последовательностями праймеров путем гибридизации и лигирования. Заключительным этапом процедуры является транскрибирование лигированных продуктов для обеспечения R-T-P-C-R повторной амплификации связанного пула кандидатов в аберы, с последующим проведением дополнительных раундов этой процедуры отбора. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают специфическое связывание выбранных аберов с белком S 100 B.

Например, здесь анализы сэндвич-связывания выполняются с использованием микрочипов, а флуоресцентно меченные вторые аберы также выполняются с использованием функционализированных нанопроволок и вторых аберов, связанных с 15-нанометровыми наночастицами золота. Сегодня мы покажем процедуру выбора оптимальных, которые связываются с белком S-сотня B из случайной библиотеки D-последовательностей. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для различных целей, в том числе для разработки сенсорной платформы для раннего выявления рака.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, сгенерируйте библиотеку ДНК без праймеров или ДНК PF, как описано ранее. Расщепление двухцепочечной библиотеки ДНК с последующей очисткой гелем с помощью 10%-ного денатурирующего полиакриламидного геля приведет к получению фрагмента из 32 нуклеотидов из пяти первичных фосфатов в 30 куб. см и 30 нуклеотидных фрагментов из пяти первичных фосфатов из 30, обозначенных как 32 плюс и 30 плюс фрагмент соответственно.

Фрагмент 32 plus содержит случайный домен из 30 нуклеотидов с минимальной фланкирующей последовательностью CC на трех простых концах, в то время как фрагмент 30 plus состоит только из последовательности случайных доменов из 30 нуклеотидов. Чтобы подготовить фрагменты ДНК библиотеки PF к аптр-селекции, ресуспендируют каждый из фрагментов 32 плюс и 30 плюс в 40 микролитрах 20 миллитрис, pH HCL 7,4. Затем нагрейте образцы в течение трех минут при температуре 85 градусов Цельсия после инкубации.

Охладите, опустите образцы на три минуты в инкубатор с водяной баней при температуре 37 градусов Цельсия, затем при 760 микролитрах отбора, буферизуйте и инкубируйте в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через три минуты подержите образец при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации пропустите раствор через колонку, содержащую гранулы никеля NTA agro, предварительно промытые отборочным буфером.

Чтобы удалить неспецифическую ДНК, соберите в библиотеке PF фрагменты ДНК, которые не связываются с колонкой, и отложите на потом. Чтобы приготовить связанные шарики S 100 B, сначала открутите 400 микролитров гранул NDA никеля в течение трех секунд в микроцентрифуге и выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте бусины 400 микролитрами связующего буфера, аккуратно пятикратно пипетируя.

Затем закрутите бусины вниз и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите это. Постирайте дважды.

Далее бедным предварительно очищенным гистидином нанесите белок на бусины. Здесь связывается человеческий S 100 с кальцием. Белок В используется осторожно, пипетируйте раствор вверх и вниз пять раз каждые три минуты в общей сложности в течение 15 минут.

Через 15 минут покрутите бусины и выбросьте надосадочную жидкость. Наконец, промойте связанный шариками S 100 B с 400 микролитрами отборочного буфера, аккуратно поглаживая вверх и вниз три раза. Снова закрутите бусины вниз и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторите этот шаг дважды, чтобы выбрать в общей сложности три финальные промывки для выбора аберов с окантовкой S 100 B. Извлеките фрагменты 32 плюс и 30 плюс, которые ранее были отложены в сторону. Добавьте фрагменты в связанную бусину S 100 B. Затем инкубируйте образец в течение 15 минут.

Перемешивание каждые три минуты путем осторожного пипетирования вверх и вниз через 15 минут кратко раскрутить шарики, отбросить надосадочную жидкость, затем промыть комплекс S 100 BDNA 800 микролитрами отборочного буфера путем аккуратного пипетирования. Затем закрутите бусины вниз и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг стирки дважды.

Для восстановления S 100 отбираются аберы на 200 мкл 20 мкм триса, HCL pH 7,4 к бусинам. Затем нагрейте кашицу в течение трех минут до 85 градусов Цельсия. Последующая инкубация.

Закрутите бусины на одну минуту и закрутите их вниз. Затем переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Повторите этот шаг один раз и объедините надосадочную жидкость.

Наконец, очистите выбранные фрагменты ДНК. Продукты ПЦР экстрагируют дважды эквивалентным объемом фенилхлороформа, изопропилового спирта. Осадите их 250 миллимолярным хлоридом натрия и в 2,5 раза больше объема 100% этанола при температуре минус 70 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Вращайтесь при температуре 21 000 GS при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость. Эффективно промойте гранулы с 75% этанолом.

Открутите при температуре 21 000 GS при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Высушите гранулу в скоростном вакууме в течение трех минут после 10 раундов отбора. Клонировать полученные ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК в топовектор ПЦР 2.1, полученный из ядра витрогена.

Затем секвенируйте от 40 до 50 одиночных колоний для каждого из отобранных фрагментов N 30 cc и N 30 с помощью прямого праймера M 13. Выровняйте выбранные последовательности с помощью программного обеспечения infomax vector NTI. Затем определите согласованные последовательности на основе выравниваний.

После того, как консенсусные последовательности были идентифицированы, приобретите консенсусные ABERS, как описано в письменном протоколе. Суспендировать первый аптамер, синтезированный с пятью простыми числами Amin C six moiety, в печатном буфере до конечной концентрации 15 микромоляров. Затем найдите раствор аптамера на слайдах, активированных кодовой ссылкой, с помощью микрогрид-массива apogen discovers.

По ссылке на код рекомендуется использовать протоколы. Распечатайте каждый слайд с 12 массивами. Используйте формат два на восемь.

Кассета для гибридизации микрочипов для гибридизации. Разбавьте белок S 100 B до соответствующей концентрации в 70 микролитрах PBS. Затем нанесите раствор на лунки микрочипа кассеты.

Запечатайте кассету с микрочипом с помощью клеевой потолочной фольги, не содержащей нуклеаз, чтобы предотвратить испарение. Дайте белку соединиться с аберами, напечатанными на кодовой ссылке. Сдержите на одном часе при комнатной температуре после инкубации по отдельности.

Лунки кассеты промойте три раза пятимиллимолярным хлоридом магния PBS или PBSM. Затем разведите флуоресцентно меченный второй абер до 0,125 микромоляра в 70 микролитрах PBSM. Нагревайте смесь в течение трех минут при температуре 85 градусов Цельсия.

Затем дайте маркированным ABERS остыть на льду. На три минуты прикладывайте аберсы к лункам кассеты микрочипа. Снова заклейте кассеты клейкой пленкой и выдержите их в течение одного часа при комнатной температуре.

Опять же, индивидуально. После промывки трижды промойте лунки PBSM. Разберите кассету и промойте весь предметный стекла PBSM.

Затем тщательно просушите предметное стекло путем центрифугирования. Наконец, отсканируйте предметное стекло с помощью сканирующего массива Packard Biosciences. 4000 XL связывали гамма P 32 A TP с пятью прайм-эндами меченых аптамеров с белком S 100 B и сравнивали с концентрацией для определения KD.

Репрезентативные kds после примерно семи раундов отбора обычно находятся в диапазоне от 10 до отрицательных семи моляров. Пять аптамеров первичного нацеливания были связаны с микрочипами с кодовой линкацией: очищенный белок S 100 B связывался с первым оптимером, а LOR 5 46 мечился вторым. Компания Optimer была привязана к первым комплексам Optimer S 100 B.

Флуоресценцию количественно оценивали с помощью сканера с матрицей сканирования. В среднем ряду показаны сэндвич-связывающие холки, характеризующиеся аддитивным связыванием в анализах KD в рядах выше и ниже. Для аберов не существует сэндвич-связывания с пятью первичными тиолдериватированными первыми аберами, которые были соединены с золотыми нанопроволоками с использованием стандартной химии тила.

Вторые аберы были соединены с 50 NMO или золотыми NPS таким же образом. Очищенный белок S 100 B затем связывали сначала с производными нанопроволоками, второй аптамер 50 наномоляров золота впоследствии связывали с первым аптамерным нанопроволокой S 100 B комплексами. Связанные сэндвич-комплексы визуализировали с помощью F FE SEM. Здесь.

Отрицательный контроль можно наблюдать при анализе связывания, выполненном с белком HTRA one вместо белка S 100 B. Итак, одна из самых важных вещей в этой процедуре заключается в том, что мы используем подход без праймеров, где у нас нет фиксированных последовательностей, которые могут вызвать ложноположительные и ложноотрицательные результаты, основанные на том, что сами последовательности подавляют случайную область. При выполнении этой процедуры важно убедиться, что матрица ДНК разрушается перед каждой реакцией обратной транскрипции, и быть осторожным, чтобы изолировать конкретный продукт R-T-P-C-R после каждой реамплификации.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.