Визуализация и количественной оценки внутриклеточного Взаимодействия Neisseria meningitidis И правам α-актинина по конфокальной микроскопии

Общей целью данного эксперимента является оценка уровня колокализации интернализованных бактерий RIA Meningitidis с цитоскелетным белком альфа-актинином. Это достигается путем инфицирования культивируемых микрососудистых клеток человеческого мозга ночным культивированием бактерий в течение трех-восьми часов, чтобы позволить бактериям проникнуть в клетки-мишени. На втором этапе клетки с внутриклеточными бактериями промывают, фиксируют, а затем проникают, что подготавливает инфицированную культуру к иммуноокрашиванию интернализованных бактерий и внутриклеточного альфа-актинина.

После конфокальной визуализации и применения программного обеспечения для колокализации можно наблюдать изображения внутриклеточной колокализации и получать количественные результаты, которые показывают, что Meninga Croci экспрессирует OPC, а также мембранный белок может специфически взаимодействовать с внутриклеточным альфа-актинином на основе конфокальной микроскопической визуализации и количественного анализа колокализации. Здравствуйте, меня зовут Изель Мария из лаборатории профессора Мата TI на кафедре клеточной молекулярной медицины Университета Бри. Сегодня мы покажем вам методику оценки уровня col, соотношения внутриклеточных бактерий с белками цитоскелета.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения взаимодействия мицелиевого менингита, экспрессирующего аутомембранный белок OPC, с цитоскелетным белком альфа-актином. Итак, давайте начнем. Эта работа должна проводиться в соответствующей лаборатории безопасности.

За два дня до процедуры иммуноокрашивания сделайте инокуляцию интересующего бактериального красителя при инфузии мозга сердца. Агаровые пластины с добавлением 10% нагретой лошадиной крови растут в течение ночи при 37 градусах Цельсия в атмосфере с 5% углекислым газом за день до иммуноокрашивания. Используйте петлю для культивирования объемом 10 микролитров, чтобы сделать суспензию бактериальной культуры на ночь.

В двух миллилитрах PBSB оставьте суспензию настояться в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы дать возможность осесть крупным бактериальным агрегатам. Далее перелейте верхний один миллилитр суспензии в стерильную пробирку, не нарушая гранулы, растворите бактерии, добавив один миллилитр 1%SDS 0,1 молярного гидроксида натрия в два флакона, содержащих 20 микролитров бактериальной суспензии и переверните пробирку для перемешивания. Для оценки численности бактерий.

Измерьте содержание нуклеиновой кислоты, определив абсорбцию раствора. При 216 антах подгоняют бактериальную суспензию до необходимой плотности в инфекционной среде для инфицирования микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека. Микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека или H-B-M-E-C-A, посеянные за два дня до иммуноокрашивания, помещают 16-миллиметровую стеклянную крышку в лунки 12-луночной пластины и засевают HBME моря при 50% слиянии на крышке, инкубируют в течение ночи при 37 градусах Цельсия в атмосфере с 5% углекислым газом на следующий день.

Заражайте клетки свежеприготовленной бактериальной суспензией в нашей лаборатории. Обычно используется коэффициент инфицирования от 200 до 300 колониеобразующих единиц на клетку-мишень. Инкубируйте в течение трех-восьми часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в конце периода заражения.

Промыть клетки три раза PBS и зафиксировать 500 микролитров 2%-ного параформальдегида в течение 30-45 минут при комнатной температуре После смывания параформальдегида стереть фиксированные паральдегидные клетки путем инкубации в 0,1% Triton X 100, разведенных в PBS, в течение 10 минут. Наконец, промойте образцы три раза PBS и приступайте к иммуноокрашиванию, как показано на рисунке. Последующее окрашивание внутриклеточных бактерий и dfor actinin может быть выполнено одновременно.

В 12-луночных планшетах закупорить покровные стекла, содержащие проницаемые клетки, 500 микролитрами 3% B-S-A-P-B-S-T на 30-60 минут. При комнатной температуре после промывки с переносом PBS каждый покровный лист переносят в новую сухую лунку в 12-луночный планшет при одновременном содержании первичных антител против бактерий и альфа-актинина. Достаточно от 80 до 100 микролитров антител на один покровный листок, если их осторожно добавить для покрытия поверхности покровного стекла, инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре В конце инкубации, добавьте 200 микролитров PBS в лунку, хорошо поднимите крышку и поместите ее в новую лунку, содержащую 500 микролитров PBS. Через пять минут удалите PBS с помощью пипетирования, а затем добавьте свежие PBS. Повторите дважды и переложите крышки в новую сухую лунку.

Далее добавьте соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с различными флуорохромами, разведенными в 1%B-S-A-P-B-S-T Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа в темноте, в конце инкубационной промывки показано ранее, затем запятнайте ДНК DPI в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте, в конце этой инкубации промойте покровные стекла в PBS один раз, а затем установите каплей крепления. Покровные стекла среднего крепления следует хранить в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к наблюдению. Под микроскопом мы наблюдаем и получаем изображения наших иммуномеченых образцов с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, прикрепленного к инвертированному эпифлуоресцентному микроскопу.

Чтобы начать процедуру CLSM с погружения в объектив и установить крышку предметного стекла, опуститься на предметный столик микроскопа, перевести микроскоп в визуальный режим и найти интересующую область с помощью окуляров микроскопа, теперь мы готовы к использованию программного обеспечения Leica. Выберите режим сбора данных XY zed. Выберите формат «пять 12 на пять» для колокализационных исследований.

Чем выше разрешение, тем точнее изображение. Затем выберите двунаправленный режим X, который увеличит скорость сканирования и поможет уменьшить обесцвечивание фотографий. Настройте параметры последовательного сканирования.

Нажмите в функции SEC, а затем выберите между линиями. Подбирайте лазерные лучи в соответствии с флуорохромами, конъюгированными с вторичными антителами. 4 0 5 нанометров для DPI 4 88 нанометров Для Alexa, Fluor 4 88 и 5 61 нанометров.

Для трикси активируйте фотоумножитель один, два и три соответственно. Настройте верхнюю и нижнюю части стека или серии Z. Следующий набор, шаг Zed с шагом 0,2 мкм.

РИА Мэн-цзы является дипло оккусом, и поскольку каждый кокус имеет приблизительный диаметр 0,5 микрометра, размер Z-шага 0,2 микрометра увеличивает вероятность сканирования каждого кокуса как минимум дважды. Установите окончательные параметры сканирования, выбрав усреднение строки из трех, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум, нажав кнопку «Пуск». Изображения с двойным или тройным окрашиванием получаются путем последовательного сканирования на разных длинах волн и использования режима между линиями для каждого канала для устранения перекрестных помех между различными хромофорами.

Чтобы указать на колокализацию двух флуорохромов, выберите функцию наложения, чтобы объединить выбранные каналы в одно изображение. Например, когда Alexa 4 88 и трисси Fluor Chromes совместно локализуют желтый цвет, желтый цвет появится в наложенном изображении для 2D-реконструкции, необходимой для визуализации возможной колокализации, компилирует стек или серию Zed с использованием функции максимальной проекции. После получения Z-стека или ряда обработайте свои данные для получения ортогонального изображения для визуализации внутриклеточной локализации различных элементов.

Количественная оценка колокализации выполняется с помощью программного обеспечения Vol City от IMP provision. Чтобы начать создание библиотеки с изображениями CLSM, выберите расширенный фокус на изображении на верхней панели. Этот инструмент объединит Zacks в 2D-изображение для анализа.

Теперь выберите инструмент КОЛОКАЛИЗАЦИЯ. Два анализируемых канала должны иметь одинаковую глубину цвета. Выберите область, которая будет количественно определена.

Установите пороговое значение для удаления любого фона. Создайте выходные данные колокализации, выбрав Создать колокализацию. Статистика колокализации будет сгенерирована для ранее выбранных областей интереса.

Далее выбираем коэффициенты мандера R и ny. Наконец, экспорт или статистические значения в документ Excel для представления данных показывают здесь репрезентативные результаты конфокальной визуализации эндотелиальных клеток мозга человека, инфицированных менингой в течение восьми часов. Местоположение бактерий показано красным цветом.

В то время как местоположение альфа-актинина показано зеленым цветом, стрелки указывают на области, где, по-видимому, произошла высокая степень накопления альфа-актинина вокруг бактерий. На этом наложенном изображении есть несколько областей, в которых появляется желто-оранжевый цвет, указывающий на колокализацию между meninga occi и альфа-актинином. На следующем изображении оптическое препарирование инфицированного монослоя H-B-M-E-C указывает на колокализацию вокруг внутриклеточных бактерий, расположенных в основании клетки.

Когда были обработаны трехмерные изображения инфицированных монослоев H-B-M-E-C, косой вид апикальной поверхности показывает бактерии Дюранта, окрашенные в красный цвет, обозначенные красной стрелкой, в то время как несколько бактерий расположены ближе к базальным поверхностям эндотелиальных клеток, обозначенным желтой стрелкой. Отчетливо оранжевое, желтое базальное расположение можно более четко увидеть в этом поперечном сечении endon XZ. В отличие от afar, эксперименты с актинином, в которых проводилось мечение интернализованных бактерий и ментона или актина, выявили случайную колокализацию с актином, но редкую колокализацию с ферментацией в клетках H-B-M-E-C.

Как было замечено в предыдущих экспериментах, ретин был сконцентрирован вокруг нескольких интернализованных бактерий, обозначенных белыми стрелками. Данные также были проанализированы для получения относительного перекрытия. Коэффициент R, который по данным Manda представляет собой истинную степень колокализации IE, количество пикселей, которые колокализуются, по сравнению с общим числом пикселей и значениями NY для альфа-актинина, ментинга и актина в целом у H-B-M-E-C, инфицированных OPC, экспрессирующими менингококки, получено более 25% перекрытия REIN в менингококках.

Коэффициент и Y являются мерой частоты валюты более обильного сигнала rein каждый раз, когда возникает менее обильный сигнал meninga cocoa. Этот показатель показывает поразительный уровень встречаемости альфа-актинина в непосредственной близости от интернализованного менинга. Мы просто покажем вам, как визуализировать и количественно оценить внедрение интернализованных бактерий с элементами цитоскелета в рамках этого эксперимента.

Важно помнить о строгом соблюдении протоколов фиксации и иммунного ствола, чтобы сохранить целостность структур и избежать высокого фона. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.