Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

Показанное здесь олигомассовое профилирование или олимпийский эксперимент позволяет быстро получить представление о структуре полимеров во внеклеточном матриксе или клеточной стенке организма. В данном случае клеточные стенки получают из рассады растений путем предварительного удаления клеточных компонентов с 70%-ным этанолом. Затем полимер целевой стенки расщепляется с помощью специального гидрокружева, растворяющего определенные компоненты стенки в форме всех связок.

Альтернативный подход заключается в расщеплении клеточной стенки с помощью фермента С-2 непосредственно на ткани. Относительная распространенность высвобождаемых связок определяется методом MALDI с помощью масс-спектрометрии и статистического анализа. Здравствуйте, я Маркус Полли из Института энергетических биологических наук Калифорнийского университета в Беркли.

Привет, меня зовут Маркус Ре.И я Аша Гиллер. Также от Института энергетических биологических наук. Организмы окружены внеклеточными матрицами, которые в зависимости от организма состоят из сложных полимерных сетей.

Быстрым и чувствительным способом оценки внеклеточного матрикса является метод, который мы называем оли масс-профилированием короткого олеума, который мы покажем вам сегодня. Эта процедура также может быть выполнена непосредственно на тканях растения. Итак, приступим.

Начните эту процедуру с выделения внеклеточного матрикса или клеточной стенки растительных тканей. Соберите пять сеянцев арабидопсиса или эквивалентное количество другого растительного материала и переложите их в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Убедитесь, что материал помещен на дно трубки.

Добавьте два трехмиллиметровых металлических шарика в реакционную трубку и заморозьте в жидком азоте. Затем измельчите замороженный образец с помощью шаровой мельницы в течение 2,5 минут при 25 герц. После измельчения материала добавьте в образец один миллилитр 70%-ного водного этанола.

Удалите металлические шарики с помощью магнита и тщательно обдуйте их вихрем. Эта обработка растворяет большинство белков и клеточных органелл: центрифугируйте образец при 14 000 об/мин в течение 10 минут, чтобы гранулировать нерастворимый в спирте остаток. Представляя материал клеточной стенки, тщательно отсасывайте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не потревожить гранулы.

Добавьте один миллилитр раствора хлороформаметанола в оставшуюся в трубке вихревую гранулу. Для ресуспендирования гранул и центрифугирования хлороформ метанол извлекает гидрофобные соединения, такие как липиды. После центрифугирования удалите налет и полностью высушите гранулу Используя вакуумную центрифугу, это завершает изоляцию материала клеточной стенки, который теперь можно обрабатывать с получением определенных связок.

Показанный здесь пример представляет собой солюбилизацию Xlo-глюкана, основной полуцеллюлозы, присутствующей в клеточных стенках двудольных растений, таких как Arabidopsis Xlo глюкан представляет собой полимер, состоящий из глюканового каркаса, который в значительной степени замещен другими остатками сахара для солюбилизации этого полимера. Для солюбилизации этой полуцеллюлозы Resus используется грибковый эндоглюкан, суспензия сухой изолированной гранулы клеточной стенки в 25 микролитрах 50 миллимолярного аммонийного формиата pH 4,5 и добавление 0,2 единицы эндоглюконата. Сделайте вихревой поток суспензии и раскрутите жидкость вниз.

Поместите трубку в миксер и дайте стенкам настояться в течение 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании. При 300 об/мин. Когда разложение выделенной клеточной стенки завершено, растворитель удаляют с помощью вакуумной центрифуги и приступают к анализу высвобождающихся олигосахаридов методом масс-спектрометрии, соли и фермент удаляют из стравливаемого образца с помощью гранул катионообменной смолы Biox MSD 5 0 1.

Сначала бусины кондиционируют, помещая необходимое количество в пустую колонку и промывая бусины большим количеством воды. Добавьте от пяти до 10 кондиционированных катионных шариков биокса в переваренный и высушенный образец. Затем добавьте 10 микролитров воды для уменьшения количества материала.

Можно использовать пять микролитров воды. Погрузите шарики в раствор, кратковременно вращая трубку, инкубируйте не менее 10 минут при комнатной температуре, пока дигестят инкубируется вместе с шариками. Нанесите два микролитра матрицы DHB на целевую пластину mal D.

Испаряйте матричный растворитель под вакуумом, что приводит к образованию химических кристаллов матрицы, теперь обнаруживайте два микролитра раствора обессоленного расщепления. Сверху кристаллы матрицы на тарелке-мишени. Растворитель пятна матрицы образца снова испаряется под вакуумом.

Важно поддерживать соответствующий период времени для смешивания жидкости матрицы образца перед кристаллизацией, как подробно описано в прилагаемом письменном протоколе. После того, как образец высохнет, поместите целевую пластину в масс-спектрометр maldi. Установите автомат в положительный режим с ускоряющим напряжением 20 000 вольт и задержкой 350 нанометров.

Выбранный диапазон массы для этих полуцеллюлозных связок составляет от 500 до 3000 Далтон. Диапазон масс должен быть изменен в соответствии с размером предполагаемых связок. Запустите лазер и соберите от 100 до 200 спектров на образец, которые скомпилируются для получения репрезентативного среднего спектра.

Это спектр целлюлозы Hemi. Метод oly, продемонстрированный в этом видео, также можно использовать непосредственно на тканях растения, исключая какие-либо этапы подготовки стенки. Эта процедура анализа in situ продемонстрирована на темных сеянцах арабидопсиса.

Образец помещают непосредственно на целевую пластину и сушат на воздухе до сухой рассады на пластине. Добавьте 0,5 микролитра соответствующей ферментной буферной смеси в нужных местах. Следите за тем, чтобы капля фермента частично касалась ткани и целевой пластины.

Поместите тарелку maldi в закрытую емкость с насыщающей влажностью, чтобы избежать высыхания капель фермента. Инкубируйте тарелку в течение 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубационного периода высушите ферментное пятно под вакуумом и добавьте 0,5 микролитра жидкой матрицы DHB поверх каждого высушенного ферментного пятна.

Затем высушите целевую пластину MALDI под вакуумом. Для анализа ЧПУ необходимо две пробы. Поместите целевую пластину, включая пятна матричного фермента образца ткани, в масс-спектрометр с записью нескольких масс-спектрометров, используя те же настройки, что и для изолированного образца клеточной стенки.

Начните направлять лазер на матрицу. Возьмите образцы кристаллов рядом с тканью. Следите за тем, чтобы не задеть саму ткань, так как в этом случае время полета молекул будет нарушено.

Соберите от 20 до 50 спектров на каждую точку и скомпилируйте их для создания репрезентативного среднего спектра. Это репрезентативный средний спектр олигосахаридов, полученных из глюкана HemosIL, присутствующего в AOP. Проростки, интенсивность ионов или высота ионов всех интересующих ионов суммируются до 100%, что приводит к относительному обилию различных олигосахаридов.

Результат метода NC two OMP дает аналогичные результаты. Каждая капля фермента, отмеченная цветным кругом, может быть проанализирована независимо, и могут быть получены и проанализированы соответствующие масс-спектры. Оола также может быть выполнена на других полимерах внеклеточного матрикса, если имеется соответствующий гидролизующий фермент.

В качестве примера можно привести спектр оолы цилина гемоцеллюлозы, присутствующего в биоэнергетической культуре. Г-жа Канус получила представленные данные, в то время как материал из листа мекампуса был переварен с помощью синь. Для присвоения структур ионам обратитесь к сопроводительному протоколу.

Мы только что показали вам процедуру массового профилирования oligo mar на экзоклеточных метриках. Полимеры, При выполнении этой процедуры важно помнить, что наилучшие результаты могут быть получены при получении однородных матричных результатов для анализа OV MS. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в экспериментах.