Dechorionation эмбрионов оризии и клеточной трансплантации для генерации химерами

Из-за жестких и мягких хориона эмбрионов, манипуляции с эмбрионами оризии более сложный, чем в данио. Это видео показывает, шаг за шагом процедуры, как манипулировать оризии эмбрионов, в том числе dechorionation, монтаж в агарозном для работы с изображениями и клеточной трансплантации для производства химеры. Эти процедуры необходимо использовать оризии и данио в лаборатории, чтобы в полной мере использовать свои дополнительные возможности для генетической вскрытия позвоночных функции генома.

Общая цель этой процедуры заключается в получении клонов в эмбрионе с целью изучения автономии интересующего гена или белка. Это достигается путем мечения донорских эмбрионов декстраном Rod Domine путем микроинъекции на стадии одной клетки, как показано в сопроводительном материале к этому видео, микроинъекции эмбрионов Maka. Вторым этапом процедуры является развитие как донорских, так и реципиентных эмбрионов до правильной стадии.

Третьим этапом процедуры является покрытие эмбрионов донора и реципиента. Заключительным этапом процедуры является пересадка клеток из меченых донорских эмбрионов в эмбрионы реципиента. В конечном счете, результаты могут быть получены путем анализа распределения, пролиферации и дифференцировки клонов, трансплантированных клеток путем обнаружения трансплантированных клеток с помощью их флуоресценции или индикаторов происхождения.

Здравствуйте, я Шон Бразински из лаборатории доктора Макото Фки на факультете биологии и биохимии Университета Бата. Я тоже из лаборатории Зеки. Сегодня мы покажем вам процедуру трансплантации клеток эмбрионов темных рыб.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для исследования с геном или мутацией, представляющей интерес, обладающей клеточной или неклеточной автономной функцией. Итак, приступим. При покрытии яиц мака используют стерильные растворы и инструменты для повышения успешности долгосрочного наблюдения и культивирования.

Поместите кусок водостойкой наждачной бумаги с зернистостью P 2000 в крышку девятисантиметровой неадгезивной чашки Петри. Используйте широкое горлышко, чтобы обжечь отполированную пипетку для макарон, чтобы перелить до 10 только что очищенных и помеченных яиц из миски с яйцом. Средними наждачной бумагой.

Удалите лишнюю среду, оставив в посуде ровно столько, сколько нужно, чтобы яйца не высохли. Кончиком пальца в перчатке аккуратно раскатайте по 10 яиц по наждачной бумаге в течение 45-60 секунд. Чтобы удалить волоски на внешней поверхности и надрезать поверхность кориана, приложите минимальное давление и держите кончик пальца параллельно наждачной бумаге.

Переложите яйца в исходную посуду среднего размера. Удалите среду, залейте яйца раствором 20 миллиграмм на миллилитр лежа. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте при температуре 27 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Обязательно расположите блюдо под углом, чтобы эмбрионы были достаточно погружены в фермент. Чтобы свести к минимуму потребность в ферментах, используйте пластиковую передаточную пипетку для извлечения проназы для повторного использования и поместите ее на лед. Промойте яйца пять раз эмбриональной средой, чтобы удалить все следы лежащего вещества, чтобы предотвратить его переваривание инкубационным ферментом.

Добавьте достаточное количество инкубационного фермента, чтобы покрыть промытые яйца. Убедитесь, что яйца остаются в один слой на дне блюда, чтобы не раздавить его по мере растворения кориана. Инкубируйте яйца при температуре 27 градусов по Цельсию.

Обязательно расположите блюдо под углом, чтобы эмбрионы были достаточно погружены в фермент. Для того, чтобы свести к минимуму необходимый фермент для проверки прогресса под препарирующим стереомикроскопом, создайте подобные отверстия во внутреннем слое кориана до того, как он полностью растворится. Процесс может занять до 60 минут в зависимости от активности фермента.

Когда небольшая часть кориана растворится, немедленно всасывайте отдельную яйцеклетку с помощью пипетки, чтобы избежать переваривания зародыша инкубационным ферментом. Переложите в чистую миску с однократным BSS, осторожно прикоснувшись кончиком пипетки к чистой чашке с однократным BSS и дав яйцу раскататься, чтобы свести к минимуму передачу инкубационного фермента. Используйте щипцы для удаления остатков кориана, когда все яйца будут перенесены из инкубационного фермента.

Сделайте окончательный перенос на новое блюдо один раз BBSS. Добавьте антибиотики, если эмбрионы должны быть доведены до более поздней стадии эмбрионального развития После декорирования для этой процедуры начните покрытие эмбрионов стадии 12 за 1,5 часа до трансплантации. С помощью наконечника пипетки добавьте небольшое количество 3% метилцеллюлозы в центр полостного микроскопа.

Вставьте девятисантиметровую чашку Петри. Распределите жидкость тонким слоем по поверхности углубления. Высушите метилцеллюлозу в течение двух минут.

Заполните углубление предметного стекла 350 микролитрами стерильного одноразового BSS под препарирующим микроскопом. Используйте пипетку из полированного стекла с широким горлышком для переноса одного донорского и до четырех эмбрионов-реципиентов на предметное стекло. Используйте петлю для волос, чтобы сориентировать эмбрионы так, чтобы дерма бластера была обращена вверх.

При необходимости прижмите эмбрионы друг к другу для устойчивости. Аккуратно введите микроиглу в донорский бластер. Кожа. Медленно принимайте от 10 до 20 клеток.

Теперь аккуратно введите иглу в соответствующую область реципиента эмбриона и медленно изгоните донорские клетки. Не нарушайте границу виолончельного мешка. Осторожно заполните чашку Петри примерно 30 миллилитрами стерильного одноразового BSS, чтобы погрузить эмбрионы и освободить эмбрионы от метилцеллюлозы.

Вылейте на бортик блюда, чтобы не нарушить зародыши. Добавьте в блюдо 100 микролитров пенициллина стрептомицина до приблизительной концентрации 0,3%. При необходимости периодически наблюдайте за эмбрионами.

Для более длительных визуализирующих исследований, таких как покадровая съемка и детальное наблюдение, встраивание живых эмбрионов с покрытием в арос обезболивает живые эмбрионы для предотвращения движения путем добавления соответствующего анестетика в среду, содержащую эмбрионы, расплавляют примерно один миллилитр 3%. Низкая температура плавления возникает за один раз BSS и поддерживается на уровне 37 градусов Цельсия. При необходимости добавьте соответствующее количество анестетика в арос, чтобы предотвратить подергивание, быстро работайте для предотвращения затвердевания, используйте пипетку для пасты с широким горлышком, чтобы заполнить колпачок. Разгибание микроцентрифужной пробирки с помощью арос.

С помощью пипетки с широким горлышком переместите один эмбрион с покрытием и под наркозом в область в колпачке. Переносите как можно меньше среды вместе с эмбрионом. Немедленно обновите арос и зародыш и переместите их в чашку Петри со стеклянным дном 3,5 сантиметра.

Переложите блюдо в 14-сантиметровую посуду, заполненную на одну треть смесью льда и воды. Крепко прижмите меньшую тарелку ко дну большой чашки под стереомикроскопом. Используйте петлю для волос, чтобы быстро сориентировать эмбрион по желанию.

Держите зародыш неподвижно до тех пор, пока агро не застынет. Теперь эмбрион можно визуализировать. На изображении А показан эмбрион донора и реципиента сразу после трансплантации.

Донорский эмбрион показан справа с полностью красной гипсовой этикеткой. Эмбрион-реципиент показан слева и легко идентифицируется по небольшой массе красных трансплантированных клеток, видимой на изображении бластера Б. На изображении В показаны два эмбриона-реципиента примерно через семь часов после трансплантации. Обратите внимание, что трансплантированные клетки мигрировали из места трансплантации и теперь рассредоточены по бластеру.

На дерматологическом изображении C показан эмбрион реципиента на стадии 29. Обратите внимание на пигментацию в глазу и наличие мефора в области туловища и мозга. Можно видеть, что клетки, меченные палочкоядным домином, колонизируют многие эмбриональные структуры, что указывает на успешное производство химеры.

Мы только что показали вам, как употреблять в пищу эмбрионы рыбы meca и проводить трансплантацию клеток на ранней эмбриональной стадии. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости пересадки донорских клеток в правильную область реципиента. Это позволит вашим донорским клеткам дифференцироваться в правильный тип клеток.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.