Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Общей целью данного эксперимента является получение рекомбинантного вируса гриппа из плазмидной ДНК. Это достигается путем пересечения восьми генов гриппа, кодирующих ДНК-плазмиды, в кокультуру из 2, 9, 3 т и клеток MDCK с использованием Lipectomy 2000 в качестве второго этапа. Супинат тканевой культуры будет использоваться для инфицирования свежих клеток MDCK и/или 10-дневных куриных эмбриональных яиц, которые будут амплифицировать вирус, присутствующий в супинате, из трансфицированных клеток.

Далее мы соберем культуры тканей, надосадочную жидкость и жидкость Алана Тоика из инфицированных куриных эмбриональных яиц. Для того чтобы подтвердить наличие вируса с помощью анализа ГК, получают результаты, которые показывают наличие вируса на основе наличия агглютинации. Здравствуйте, меня зовут Луис Мартинес Рито, я работаю на кафедре микробиологии и иммунологии в Университете Рочестера.

Сегодня я покажу вам, как спасти рекомбинантные вирусы гриппа из плазмидной ДНК. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения многочисленных аспектов биологии вируса гриппа и разработки потенциальных векторов и вакцин. Итак, давайте начнем.

Перед началом трансфектировать теплые реагенты клеточной культуры до 37 градусов Цельсия, однократно фосфатно-солевой буфер, P-B-S-E-D-T-A, трипсин и модифицированный КО КО средний DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой FBS и 1% пенициллина стрептомицина PS. Затем приготовьте 250 микролитров среды opti MEM и от шести до восьми микролитров LPF 2000 на трансфекцию и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти-10 минут. Приготовьте смесь для трансфекции плазмид, добавив один микрограмм плазмидной ДНК в пробирку с 50 микролитрами среды opti MEM. Добавьте по одному микрограмму каждой из восьми плазмид PDZ, содержащих вирусные сегменты.

PB two PB one pa ha np na m и N MS. Добавьте 250 микролитров препарата комнатной температуры opti MEML PF 2000 в смесь для трансфекции ДНК гриппа и инкубируйте от 20 до 30 минут при комнатной температуре. Тем временем приготовьте суспензии 2 9 3 Т и MDCK клеток для трансфекции. Плотность клеток 2, 9, 3 T и MDCK должна быть на уровне от 80 до 90%.

В день трансфекции, примерно от пяти раз по 10 до шести клеток на 100 миллиметров. РЕСУСПЕНДИРОВАТЬ 2 9 3 Т-клеток в трех миллилитрах D-M-E-M-F-B-S-P-S. Когда Resus приведен в действие, подайте три миллилитра в клетки MDCK для ресуспензии.

Таким образом, будет создана смесь 2, 9, 3 Т и клеток MDCK, которая будет использоваться в качестве совместного культивирования. Добавьте 250 миллилитров 2 9 3 T-M-D-C-K клеток на лунку в шестилуночный планшет. Через 20–30 минут добавьте по одному миллилитру DMEM 10%FBS 1%PS в каждую из смесей ДНК гриппа OPTI M-E-M-L-P-F 2000.

Затем добавьте в лунки по 250 миллилитров 2, 9, 3 T-M-D-C-K клеток. Осторожно встряхните шестилуночную пластину и дайте трансфекции инкубироваться в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день, через 16-24 часа после трансфекции, смените трансфекционную среду и инкубируйте трансфицированные клетки в DMEM 0,3% бычьего альбумина или BA 1%PS, содержащего один микрограмм на миллилитр Ltosil lado, два фенола, этилхлорметилкетона или обработанный TPCK трипсин в течение 48 часов.

Если инфекция MDCK желательна на планшете свежими клетками MDCK за сутки до заражения или через два дня после первичной вирусной трансфекции, то через 48 часов после смены среды перенос SUP-натанта из трансфицированных клеток в микроцентрифужную центрифугу-пробирку. Тканевая культура насыщается в микроцентрифуге в течение одной-двух минут при 13 000 оборотах в минуту до инфицирования клеток MDCK. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить монослой, затем приступайте к заражению Промойте клетки дважды одним миллилитром одного раза PBS.

Добавьте 200 микролитров надосадочной жидкости для центрифужных культур с предыдущих этапов и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Раскачивайте пластину каждые 10 минут, чтобы избежать высыхания клеток после одного часа всасывания вируса. Удалите инфекционную среду из клеток MDCK и добавьте два миллилитра DMEM 0,3%BA 1%PS, содержащий один микрограмм на миллилитр трипсина TPCK.

Цитопатический эффект будет наблюдаться в инфицированных клетках MDCK через 48-72 часа после пассажа. В зависимости от эффективности трансфекции и вирусной нагрузки цитопатические эффекты заключаются в округлении клеток, гибели и отрыве от поверхности и т.д. Затем изолируют snat из клеток MDCK для анализа, чтобы подтвердить наличие вируса в культуре тканей.

Надосадочная жидкость микроцентрифуги выводит надосадочную жидкость в течение одной-двух минут при 13 000 об/мин для удаления клеточного мусора и переноса в новую центрифужную пробирку для заражения куриных эмбрионов из яиц. Зажгите 10-дневные яйца с помощью легкой коробки-миражирования, чтобы увидеть границу раздела между воздушным мешком и полостью Allen Toic. Сделайте отметку карандашом на границе сопряжения пятимиллилитровой иглой для шприца.

Сделайте отверстие в яичной скорлупе с помощью одномиллилитрового шприца. Инфицируйте каждую яйцеклетку 200 микролитрами надосадочной жидкости, полученной ранее. Замажьте отверстие в яичной скорлупе расплавленным воском с помощью ватного тампона.

Инкубируйте зараженные яйца при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех дней до сбора жидкости Алана Тоика. Инкубируйте куриные яйца в течение двух часов или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы убить куриный эмбрион и после этого свертнуть кровь. Вымойте яичную скорлупу с 70% этанолом для создания стерильных условий.

Осторожно откройте яйцо над воздушной полостью, постукивая ложкой. Удалите разбитую яичную скорлупу с помощью щипцов с иглой объемом в один миллилитров. Удалите мембрану Алана Тоика, не разбивая яичный желток.

Стабилизируйте куриный эмбрион с помощью шпателя и введите 10 миллилитровую пипетку в жидкость Алана Тоика. Соберите как можно больше жидкости Алана. От восьми до 12 миллилитров в 15-миллилитровую центрифужную пробирку на лед для каждого яйца.

Не разбивайте и не собирайте центрифугу для яичного желтка в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия и перелейте жидкость Alan Toic в свежие 15-миллилитровые центрифужные пробирки на льду, где находятся пробирки, содержащие центрифугу. Алан Тоик протекает при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока их не проверят на наличие спасенного вируса с помощью анализа на ГК. Анализ ГК проводят с использованием 96-луночных планшетов VBO, отрицательный контроль с использованием PBS one X и положительный контроль культуры тканей.

Supinate и/или Alan Toic. Жидкость из инфекции, вызванной вирусом гриппа, не являющейся RES, всегда должна быть включена в анализ NAHA. Дозируйте 50 микролитров PBS по одному X в каждую лунку 96-луночного планшета V-образного дна, добавьте 50 микролитров надосадочной жидкости MDCK для культуры тканей и/или жидкости Алана Тоика из зараженных яиц в первую лунку и сделайте двукратные последовательные разведения для следующих лунок.

Откажитесь от лишних 50 микролитров от последнего. Хорошо добавьте 50 микролитров от 0,5 до 1% куриных эритроцитов в каждую лунку, инкубируйте пластину с V-образным дном 96 лунок в течение 30-45 минут на льду или до красного цвета. видно на дне отрицательного контрольного образца PBS наличие вируса в супернатантах культуры тканей MDCK и/или в жидкости LAN toic из инфицированных яиц можно определить макроскопически с использованием гемагглютинина курицы, эритроцитов.

Присутствие вируса вызывает агглютинацию крошки, в то время как отсутствие вируса позволяет образованию красной гранулы на дне скважины. Кроме того, существование округления клеток ЦПД с поверхности и т.д. в клетках, инфицированных надосадочной жидкостью тканевой культуры или жидкостью LAN toic из яиц, предполагает положительное спасение вируса в случае вируса гриппа, требуется примерно от 10 до 3-10 до четырех звеньев, образующих бляшки или PFU, чтобы дать положительный сигнал в анализе HA. Таким образом, иммунофлуоресцентный анализ может быть проведен параллельно с анализом на ГК для подтверждения истинно отрицательного результата.

Поскольку присутствие отдельных вирусных частиц может быть обнаружено путем окрашивания инфицированных клеток флуоресцентно мечеными антителами, возможно, что HA-отрицательные супернатанты или жидкости Алана Тоика являются положительными при использовании иммунофлуоресцентных анализов. В этом случае вирус должен быть усилен путем упаковки в клетки MDCK или яйца. Жидкости и/или супернатанты культуры тканей Алана Тоика из второго пассажа теперь должны быть явно положительными в анализе ГК.

Итак, мы только что увидели вас, как спасти вирусы гриппа из плазмидной ДНК. Спасение вирусов гриппа из плазменной ДНК является простым и понятным процессом. Во-первых, протокол первоначально был составлен в лаборатории для спасения рекомбинантных вирусов гриппа из плазменной ДНК.

Мы рекомендуем три независимых трансфекта для каждого рекомбинантного вируса. Если предпринимаются попытки спасения более чем одного рекомбинантного вируса гриппа, масштабируйте шаги в соответствии с количеством вирусов, подлежащих спасению. Следующий протокол трансфекции и инфекции для спасения рекомбинантных вирусов гриппа из плазменной ДНК является навыком для шести лунок.

Все процедуры по забору LAN-тоиковых жидкостей из инфицированных яиц проводятся в стерильных условиях. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.