Оценка функции сердца и энергетика в изолированном сердце мыши, используя ³¹ P ЯМР-спектроскопии

Общей целью данного эксперимента является наблюдение за сердечной функцией и энергетикой в изолированном перфузированном мышином сердце. Это достигается за счет перфузии сердца мыши в режиме LOR. С помощью буфера Krebs, обогащенного глюкозой и пируватом, в качестве второго шага в левый желудочек или ЛЖ вводится наполненный водой баллон, что позволяет постоянно контролировать сердечную функцию во время эксперимента.

Затем сердце помещают в 10-миллиметровую ЯМР-трубку и вставляют в магнит для оценки сердечной энергетики путем наблюдения за резонансами фосфо-креатинфосфатов ТП, и были получены результаты по неорганическим фосфатам, которые показывают сердечную функцию и энергетику на основе волн давления ЛЖ и P 31 и масс-спектроскопии p. Привет, Меня зовут Стив Китц (Steve Kitz) из Центра кадрового метаболизма Массачусетского технологического института на кафедре анестезиологии Вашингтонского университета. Сегодня я покажу вам процедуру изолированной перфузии сердца в сочетании с 31 ПНМР-спектроскопией.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для оценки сердечной функции и энергетики на наших биоинженерных моделях мышей. Итак, приступим. Для начала этого протокола подготовьте один литр креса, следовательно, легкий или KH буфер.

Введите в смесь 5% углекислого газа и 95% пузырьков кислорода на 10-15 минут. Затем добавьте два миллимоляра хлорида кальция, а затем субстраты, 10 миллимолярной глюкозы и 0,5 миллимолярного пирувата. Для этих экспериментов одновременно используются две отдельные системы для получения спектров P 31

Магнит BRUER 14 T сопряжен с усовершенствованной тройкой консолей и компьютером, оснащенным программным обеспечением top spin V 2.1 для оценки сердечной функции. Изготовленная по индивидуальному заказу система перфузии сердца подключена к силовой лаборатории. Четыре заявки на 30 данных.

Оснащен лабораторной картой PRO six программным обеспечением для анализа данных. Аппарат для перфузии сердца включает в себя мини-импульсный трехперистальтический насос, управляемый контроллером насоса STH, используемый для перфузии буфера KH в регуляцию температуры сердца во время эксперимента ЯМР, что имеет решающее значение. Нагреваемые термостаты используются для поддержания температуры в диапазоне от 37,0 до 37,5 градусов Цельсия, когда сердце находится внутри магнита, а температура контролируется в течение всего эксперимента с помощью оптоволоконного температурного зонда.

На протяжении всего эксперимента давление ЛЖ и давление перфузии контролируются с помощью датчиков давления, которые подключены к системе сбора данных и отображаются с помощью прилагаемого программного обеспечения. Физиологический датчик используется для контроля давления ЛЖ, а одноразовый датчик артериального давления используется для контроля перфузионного давления. Наконец, пуповина используется для подачи нагретого насыщенного кислородом буфера к сердцу.

Оказавшись внутри магнита, перед началом эксперимента откалибруйте датчики давления с помощью стандартного манометра фигового момента, в первую очередь без давления в преобразователе, чтобы обнулить калибровку. Затем накачайте этот инжирный режим манометра до более высокого давления. Введите это значение в компьютерную программу.

Затем подтвердите, что датчики давления были адекватно откалиброваны, накачав этот манометр до известных давлений и проверив их на экране компьютера. После калибровки датчиков давления откалибруйте ЯМР-зонд с помощью 10-миллиметровой ЯМР-трубки, содержащей стандартный образец 150 миллимолярного фосфата натрия. Выполните калибровку с помощью программы Top Spin

Во-первых, настройте образец на заданную частоту резонанса фосфора. Затем наложите на образец прокладку, чтобы создать однородное магнитное поле. Такая первоначальная калибровка облегчает передачу сигнала и сокращает время, необходимое для начала периода регистрации.

После того, как сердце будет расположено внутри зонда, чтобы начать экстракцию сердца мыши, введите мышь 200 единиц гепарина внутрибрюшинно, чтобы уменьшить коагуляцию. Через пять минут введите 175 мг на килограмм натрия пентабарбитала внутрибрюшинно. Как только мышь будет обезболива, положите ее на спину и обмотайте скотчем руки и ноги, чтобы обнажить область грудной клетки.

Выполните сжатие пальцев ног, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболивается. Резать. Вскройте брюшную полость и грудную клетку ножницами и с помощью щипцов отклейте грудную клетку и обнажите грудную полость с помощью щипцов. Держитесь за легочную ткань и аккуратно поднимите сердце изогнутыми ножницами.

Разрежьте большие сосуды позади сердца и продолжайте медленно двигаться к голове мыши, пока сердце не освободится. Немедленно остановите сердце в ледяном буфере KH. Держите органы на льду и быстро удаляйте легкие.

Определите доли тимуса и аккуратно отшлифуйте их, чтобы обнажить аорту. Затем удалите тимус. Наконец, изолируйте аорту, осторожно удалив все окружающие ткани.

Используя микрощипцы для наложения швов, обычно удерживайте обе стенки аорты, чтобы обнажить просвет. Затем осторожно поместите аорту на канюлю. Изготовлен из полиэтиленовой трубки с внешним диаметром 0,965 мм.

Удерживайте аорту на месте с помощью зажима для микрососудов и быстро завяжите швы вокруг аорты. После того, как швы будут завязаны, снимите зажим. С помощью щипцов тщательно проверьте, чтобы канюля находилась над корнем аорты.

Добавьте любые дополнительные завязки, которые необходимы для удержания сердца на месте. Удалите лишнюю ткань с помощью щипцов и микроножниц. Затем сделайте небольшой надрез в левом оракуле.

Аккуратно удерживайте сердце и осторожно введите полиэтиленовую трубку толщиной 0,61 мм через левое предсердие, левую полость желудочка и наружу через верхушку. Обрежьте лишнюю трубку. Далее вставьте спущенный баллон, наполненный водой, через предсердие в левый желудочек.

Удерживайте баллон на месте с помощью скотча. Затем постепенно увеличивайте скорость перистальтического насоса, чтобы обеспечить достаточный приток к сердцу. Продолжайте перфузировать сердце с помощью KH-буфера, используя постоянный поток, эквивалентный примерно двум миллилитрам в минуту, пока сердце не будет помещено в зонд ЯМР.

Надуйте баллон ЛЖ с небольшим объемом с помощью микрометрического шприца, чтобы убедиться, что преобразователь давления ЛЖ функционирует для ЯМР-спектроскопии. Сначала осторожно вставьте сердце в 10-миллиметровую ЯМР-трубку. Вокруг ЯМР-трубки размещается широкая вертушка кабана, которая помогает направлять трубку в нужное положение.

Внутри щупа плотно прикрепите весь аппарат к пуповине с помощью клейкой ленты. Затем медленно опустите пуповину в верхнее отверстие магнита до тех пор, пока ЯМР-трубка, содержащая сердце, не окажется внутри катушки 10-миллиметрового ЯМР-зонда. Как только сердце окажется в правильном положении внутри зонда, отрегулируйте поток паразитного насоса так, чтобы достичь перфузионного давления в 80 миллиметров ртутного столба.

Поддерживайте давление перфузии путем включения удерживающего механизма на контроллере насоса. Дайте сердцу период уравновешивания от 15 до 20 минут. В период равновесия отрегулируйте объем баллона LV так, чтобы достичь конечного диастолического давления от восьми до 10 миллиметров ртутного столба.

Затем оптимизируйте параметры спектрометра с целью получения наилучшего возможного фосфористого сигнала. Настройте прибор ЯМР, установив радиоимпульс таким образом, чтобы частота резонировала ядром фосфора. Затем прокладку образца для придания магнитному полю однородности после периода равновесия.

Начните сбор нескольких спектров ЯМР P 31. Период регистрации для каждого спектра зависит от напряженности поля магнита, размера выборки и соотношения сигнал/шум, необходимого для конкретного эксперимента. Здесь спектры получены с помощью магнита 14 Тесла путем усреднения сигнала, полученного из 256 радиочастотных импульсов по 20 микросекунд с углом поворота 60 градусов и задержками 2,0 секунды.

Этот эксперимент займет примерно 10 минут. Типичный показатель сердечной функции, развиваемое давление ЛЖ, получается путем вычитания конечного диастолического давления или EDP из систолического давления. У нормальной мыши C 57 «черная шестерка» развиваемое сердечное давление ЛЖ обычно составляет от 100 до 110 миллиметров ртутного столба при фиксированном диастолическом давлении от восьми до 10 миллиметров ртутного столба.

Репрезентативные кривые стилизации показаны на примере контрольных и аортальных полосатых мышей. Систолическая функция представлена создаваемым давлением ЛЖ над увеличением объемов ЛЖ, определяемых объемом баллона ЛЖ. Диастолическая функция представлена ЭДП по возрастающим объемам ЛЖ.

Спектры ЯМР P 31 изолированного перфузионного мышиного сердца дают сигналы фосфокреатина или ПЦР, трех фосфатов из ТП и неорганического фосфата или пи. Здесь пик PI относительно невелик. Это типично для аэробно развитого сердца, снабженного пируватом или жирными кислотами.

В дополнение к глюкозе в периоды ишемии этот пик увеличивается, в то время как пик ПЦР снижается. Я только что показал вам, как подготовить сердце мыши к перфузии, чтобы во время эксперимента можно было одновременно измерять и сердечную функцию, и энергию. Важно убедиться, что сердце адекватно перфузировано.

В противном случае ваши данные ЯМР не будут надежными. Вот и все. Спасибо и удачи в ваших экспериментах.