Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии

Изучение реакции клеток на механическую стимуляцию в реальном времени осуществляется путем выращивания первых клеток, экспрессирующих гибридные белки GFP на стеклянных донных чашках в течение 24 часов. Вторым шагом является покрытие наконечника A FM биотинилированным фибронектином. Затем функционализированный FM-кончик вступает в контакт с поверхностью клетки, чтобы обеспечить формирование сильной фокальной адгезии вокруг A FM-кончика, что позволяет напрямую манипулировать актовым цитоскелетом через матричную интегрин-актиновую связь между кончиком, покрытым фибронектином, и клеткой.

Заключительным этапом является механическая стимуляция живой клетки путем контролируемого движения вверх наконечника A FM таким образом, чтобы вертикальная сила прикладывалась в точке контакта с клеткой без нарушения сильной фокальной адгезии. В конечном счете, результаты показывают, что клетки реагируют на механическую стимуляцию, усиливая свое прикрепление к субстрату и вызывая реорганизацию цитоскелета актина, как это регистрируется с помощью флуоресцентной оптической визуализации в реальном времени. Здравствуйте, меня зовут Андреа Трейк, я доцент кафедры системной биологии и трансляционной медицины в Техасском научном центре здоровья.

Привет, я Сум Лим. Я являюсь постдокторантом на кафедре системной биологии и трансляционной медицины в Техасском центре медицинских наук. Сегодня мы покажем вам процедуру изучения адаптивного клеточного ремоделирования в механической стимуляции.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для исследования ремоделирования цитоскелета в реальном времени в живых клетках гладких мышц сосудов. Итак, давайте начнем. Для этих исследований используется инвертированный микроскоп Olympus IX 81 с флуоресценцией полного внутреннего отражения или насадкой для газона в сочетании со сканирующей головкой CSU 22 Yokogawa.

Биоскоп атомно-силовой микроскоп SZ установлен в верхней части инвертированного оптического микроскопа. Вся система смонтирована на оптическом столе исследовательского класса и ранее была подробно описана. В этом интегрированном микроскопе используются два квантовых ЭМ устройства с умножительной зарядовой связью электронов или камеры E-M-C-C-D.

Один из них предназначен для визуализации газона, а другой — для конфокальной визуализации. Конфокальная сборка, состоящая из вращающегося диска сканера, внешнего фильтрующего колеса и камеры E-M-C-C-D, установлена на алюминиевой опорной пластине, размещенной поверх силиконовой прокладки, необходимой для гашения вибраций. Весь конфокальный узел соединяется с микроскопом через фланец с резьбовым кольцом.

Таким образом, сборка может быть отделена от микроскопа во время атомно-силовой микроскопии или FM-измерений, чтобы избежать вибрации от вращающегося дискового сканера. Аргонокриптоновый лазер используется в качестве источника возбуждения как для газоновой, так и для конфокальной визуализации. Лазер может быть соединен с любым из двух оптических волокон, которые подают лазер к насадке для газона или к конфокальной сканирующей головке.

Во-вторых, компьютеры управляют системой. В одном из них используется программное обеспечение для слайдбука, которое управляет оптической визуализацией, а в другом — программное обеспечение для наноскопа, которое управляет A FM за 24 часа до эксперимента по механической стимуляции, помещая живые клетки, экспрессирующие конструкции GFP, нацеленные на определенные белки, в чашку для клеточной культуры со стеклянным дном. В день эксперимента замените среду для культивирования клеток фенольной красной свободной средой.

Поскольку эксперимент с FM очень чувствителен к шуму, избегайте разговоров или прикосновений к оптическому столу или микроскопу во время эксперимента, чтобы свести к минимуму шум. При измерениях в FM-диапазоне отсоедините конфокальный вращающийся диск от микроскопа. Эксперимент начинается с установки чашки для клеточных культур на FM-столик с магнитным кольцом для крепления чашки к столику магнитного микроскопа.

V-образный консоль на датчике A FM изготовлен по индивидуальному заказу с помощью двухмикронного биотинилированного стеклянного шарика. Консоль можно легко увидеть с помощью микроскопа. Валик приклеивается на самый конец консоли, и именно на него следует наносить раствор покрытия по каплям.

Чтобы подготовить FM-зонд к эксперименту, сначала установите наконечник в держатель для стаканов, а затем поместите держатель для стакана на настольное крепление, чтобы покрыть наконечник. Промойте наконечник, осторожно капнув 10 микролитров фосфатного буферного раствора docos или DPBS на самый конец наконечника, а затем используйте салфетку кима, чтобы высушить наконечник. Повторите эту процедуру пять раз после стирки с DPBS из расчета один миллиграмм на миллилитр.

Заядлый в растворе. По каплям над кончиком. Дайте кончику поинкубироваться в течение пяти минут после нанесения покрытия авадоном.

Промойте наконечник еще пять раз с помощью DPBS. Затем сшите биотинилированный фибронектин с авадоном, добавив один миллиграмм на миллилитр раствора. По капле на кончик и выдерживать в течение пяти минут.

Наконец, снова промойте наконечник пять раз DPBS, оставляя последнюю каплю на наконечнике. После того, как наконечник будет подготовлен, установите его на FM-сканер. После установки наконечника FM поместите защитную силиконовую юбку вокруг держателя.

Затем настройте микроскоп для просмотра видео. Затем выровняйте наконечник FM по центру поля зрения. Установите оптический рычаг, поместив лазерный луч в самый конец консоли.

Затем смените объектив на подходящий объектив с большим увеличением для визуализации одной клетки. Затем выведите в поле зрения клетку, которая будет механически стимулироваться, и выберите место, где наконечник A FM должен приземлиться на поверхность клетки. Наконец, опустите наконечник FM до тех пор, пока он не коснется этой конкретной ячейки.

После того, как наконечник соприкоснулся с клеткой, подождите примерно 20 минут. Это позволяет формировать сильную фокальную адгезию в точке контакта FM на поверхности клетки. После периода ожидания можно приступать к процедуре механической стимуляции, чтобы подготовиться к эксперименту по механической стимуляции.

Переключитесь с видеокамеры на камеру E-M-C-C-D, чтобы можно было просматривать флуоресцентные клетки для визуализации. Затем получите исходное изображение клетки в состоянии покоя. Используйте вращающийся диск и голосовую микроскопию для визуализации действия в цитоскелете по всему телу клетки.

И наоборот, используйте газон для визуализации очаговых спаек для стимуляции клетки. Используйте консоль для контролируемого движения вверх дискретными шагами каждые три-пять минут. При получении данных A FM важно, чтобы оператор постоянно контролировал напряжение в положении Z piso, чтобы определить правильное время для вертикальной стойки.

Одновременно с получением данных FM записывайте конфокальное или газонное изображение клетки после каждого вертикального вытягивания с помощью программного обеспечения для слайдбука. Наконец, извлеките наконечник FM из клетки после завершения эксперимента по стимуляции. Трансфект гладкомышечных клеток сосудов актином MRFP и vcul.

GFP визуализировали с помощью FM на поверхности апикальной клетки. Эта же клетка была визуализирована с использованием дерна на поверхности базальной клетки. Здесь два изображения накладываются друг на друга.

Изображение той же клетки также было получено с помощью конфокального вращающегося диска по всему телу клетки и показано в виде максимальной проекции 3D-стека. Показаны хорошие перекрытия между изображениями A FM и конфокальным изображением вращающегося диска. Гладкомышечные клетки сосудов, трансфицированные актином MRFP, были механически стимулированы с помощью A FM и визуализированы с помощью конфокальной микроскопии вращающегося диска.

Ошибки указывают на действующие волокна, которые демонстрируют заметную реструктуризацию при FM-стимуляции. Некоторые действующие волокна полимеризуются, в то время как другие деполимеризуются из-за механической стимуляции, другие действующие волокна связываются вместе. В связи с реструктуризацией актов, мы только что показали вам, как механически стимулировать культуру продажи жизни с помощью EFM, одновременно регистрируя перестановку CY с помощью оптических методов визуализации.

При проведении этой процедуры важно помнить, что эксперимент с FM чрезвычайно шумный, чувствительный. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших высказываниях.