Ориентация глубинных структур мозга с Микроинъекции для доставки лекарственных средств, вирусные векторы, или клеточных трансплантатов

Общая цель этой процедуры заключается в выполнении высокоточных микроинъекций в глубокие структуры мозга для доставки лекарств, вирусных векторов или клеточных трансплантатов. Это достигается за счет первого производства стеклянных капиллярных игл с просветом 50 микрометров. Вторым этапом процедуры является заполнение иглы на 50% минеральным маслом капиллярным путем и введение поршня самым широким концом трубки.

Третий этап процедуры заключается в том, чтобы нагрузить иглу веществом или клеточной суспензией, которую вы хотите ввести. Заключительным этапом процедуры является введение кончика иглы и введение вещества с очень низкой скоростью потока в глубокую структуру мозга. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают очень точное нацеливание веществ на мозг с помощью микроинъекций со стеклянной капиллярной трубкой.

Здравствуйте, меня зовут Оскар Гонсалес из лаборатории нейробиологии в Школе психологии Университета Колимы, Мексика. Сегодня мы покажем вам процедуру выполнения микроинъекции со стеклянной капиллярной трубкой для доставки лекарств в мозг мыши. Мы используем эту процедуру в достаточно лабораторных условиях для изучения взрослых нервных стволовых клеток.

Итак, приступим. Использование стеклянных капиллярных игл с просветом 50 микрометров для микроинъекций в мозг значительно снижает повреждение мозга, сводит к минимуму пассивную диффузию лекарств и позволяет точно нацеливаться на мозг грызунов. Прежде чем выполнять микроинъекции, необходимо сконструировать стеклянные иглы.

Начните с помещения капиллярной стеклянной трубки в тянущий электрод с высоким сопротивлением съемника микропипетки. Далее включите электрод съемника микропипетки. Чтобы нагреть середину стеклянной трубки для локального размягчения стеклянной трубки, растяните стеклянную трубку вдоль ее продольной оси на первоначальное расстояние от трех до пяти миллиметров, достаточное для того, чтобы вызвать уменьшение диаметра стеклянной трубки в локализованной области.

Продолжайте растягивать стеклянную трубку, пока она не разобьется. Повторите эти шаги, чтобы создать две одинаковые иглы с одним бочонком. Теперь поместите стеклянные иглы в микрокузницу.

Для скоса кончика достаточно угла в 30 градусов. Наконец, поместите иглы под микроскоп и убедитесь, что они обе имеют правильный внутренний диаметр. Для большинства гидрофильных препаратов внутренний диаметр от 30 до 50 микрометров является идеальным с помощью сконструированных игл.

Давайте разберемся, как использовать их для микроинъекций. Для начала заполните сконструированную иглу минеральным маслом с самого широкого конца. Дайте минеральному маслу проникнуть капиллярным путем, пока оно не достигнет примерно 50% длины капиллярной трубки.

Нанесите высоковакуумную смазку на самый широкий конец иглы и вставьте через него поршень. Аккуратно вдавливать минеральное масло до тех пор, пока маленькая капля сцены не выйдет из кончика стеклянной иглы. Теперь закрепите иглу в держателе микроинъектора и начните подготовку животного к инъекции.

Во-первых, наденьте грелку на стереотаксический держатель для животных, чтобы поддерживать температуру тела животного. При температуре 37 градусов Цельсия выбрейте голову мыши, находящейся под наркозом, затем поместите и закрепите ее в стереотаксическом устройстве. Используя амбушюры и держатель для зубов, с помощью хирургического лезвия разрежьте кожу от ушей до линии черепа Лямбда.

Отполируйте череп ватным тампоном, чтобы высушить его и вытянуть кожу из операционного поля. Далее с помощью кончика стеклянной иглы укажите на вершину шва bgma и установите там начальное положение инъекции. Теперь установите точку на черепе, которую необходимо просверлить, переместив оси X и Y стереотаксического устройства над черепом.

С помощью исследовательского микросверла тонкими щипцами тщательно просверлите отверстия в выбранных координатах. Аккуратно удалите самый глубокий слой кости и разломайте твердую мозговую оболочку. Вы увидите, как из головного мозга вытекает спинномозговая жидкость.

Чтобы убедиться, что игла может пройти через просверленные отверстия, медленно опустите стеклянную иглу с помощью оси Z стереотаксического устройства. Теперь пипеткой наберите один микролитр препарата для введения и поместите его на небольшой кусочек отдушки. Поместите парфюм на череп.

Всасывайте лекарство, вращая колесо микроинжектора, пока вы проверяете через микроскоп, что жидкость поднимается вверх в стеклянную иглу. Снимите пара-пленку и сбросьте нулевую координату. Теперь переместите иглу на выбранные координаты и опустите держатель до тех пор, пока кончик стеклянной иглы мягко коснется поверхности мозга и установите Z.Coordinate на ноль.

Введите стеклянную иглу в паренхиму мозга на нужную глубину. Вводите препарат медленно со скоростью около одного нанолитра в секунду. Когда нужный объем будет введен внутрь, дайте препарату диффундировать в паренхиму в течение двух минут, а затем приступайте к извлечению иглы плавно и медленно.

Окончательно заклейте операционную рану и извлеките животное из стереотаксического аппарата. Поместите животное в довоенную клетку для восстановления после анестезии. Теперь мы покажем некоторые результаты микроинъекций.

Лизофосфатидилхолин или лиин вводили в коссумовое тело, которое вызывает демиелинизацию трактов белого вещества, чтобы свести к минимуму повреждение мозга, вызванное стеклянной иглой. Было введено всего 20 литров лиина. Демиелинизация представлена отсутствием экспрессии основного белка миелина в трактах белого вещества, получается очень точная инъекция и очень узкий игольчатый тракт сводит к минимуму повреждение головного мозга.

Мы только что показали вам, как сконструировать стеклянные иглы для выполнения микроинъекций в глубокие структуры мозга. При проведении этой процедуры важно помнить о том, что все оборудование и материалы должны быть готовы к использованию в хирургической комнате. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.