Дважды флуоресценции На месте Гибридизация в пресной разделы мозга

Здравствуйте, я JA, postdoctoral research associate в лаборатории AL в Университете Рочестера. Мы продемонстрируем вам метод гибридной дигестии Process Institute в свежезамороженных срезах мозга для одновременного детектирования двух транскриптов мРНК с одноклеточным разрешением. Этот метод поможет вам ответить на вопросы в области нейробиологии, например, касающиеся анатомической, функциональной, молекулярной и нейрохимической организации конкретных нейронных цепей мозга.

Хотя данный метод позволяет получить представление о коагуляции генов в нейронах головного мозга AV, его также можно применять к другим системам, таким как грызуны, а также к различным типам нейронных тканей. Для начала процедуры гидратируйте достаточное количество порошка SDX G 50 с РНК с помощью воды.

Кратковременно перемешайте раствор и выдержите при комнатной температуре от двух до пяти минут. Этот этап позволяет отделить частицы SDX от декстрозы, содержащейся в коммерческом порошке sedex, после осаждения Sedex G 50. Удалите супернатант и повторите процесс три-пять раз; после финальной промывки повторно суспендируйте раствор SX G 50 в буфере TE в соотношении объема буфера к объему частиц 1:1 и храните при температуре 4 °C до использования.

Затем подготовьте колонки. Поместите автоклавированную стеклянную вату в стерильный шприц объемом 1 мл и прижмите ее поршнем, чтобы создать плотный слой на дне. После этого поместите шприц в пробирку Falcon объемом 15 мл.

Заполните колонки раствором Sedex G 50, центрифугируя при 1000 об/мин в течение 30 секунд с использованием центрифуги Beckman, оснащенной фиксированным угловым ротором C 0 6 5 0. После центрифугирования промойте каждую колонку, добавив 200 µL буфера для промывки колонок и центрифугируя в течение двух минут при 1000 об/мин.

Как и прежде. В завершение нанесите по 200 µL блокирующего буфера для колонок в каждую колонку и центрифугируйте в течение двух минут при 1000 об/мин. Повторите этот шаг четыре-пять раз для уравновешивания колонки.

Храните подготовленные колонки при температуре 4 °C до тех пор, пока РНК-зонд не будет мечен и готов к очистке для процедуры двойной флуоресцентной гибридизации in situ или D-FISH, показанной здесь. Готовят два РНК-зонда: один метит дигоксигенином (DIG), а другой — биотином. Начните мечение зондов с приготовления растворов для мечения РНК-зондов и инкубации реакций мечения на водяной бане при 37 °C в течение двух часов. По окончании двухчасовой инкубации добавьте в каждую реакцию мечения 1 µL тРНК в концентрации 20 µg/µL и 39 µL блокирующего буфера для колонок.

Затем подготовьте колонки EDEX G 50 для очистки зондов, добавив в каждую колонку 50 µL блокирующего буфера и центрифугируя в течение трех минут при 2000 об/мин. Повторите этот шаг два или три раза для уравновешивания колонок. После подготовки колонок поместите новую пробирку EEND orph под основание колонки.

Нанесите раствор зонда на колонку Sedex G 50 и центрифугируйте в течение трех минут при 2000 об/мин. Чтобы получить 50 µL очищенного раствора рибозонда, оцените качество и выход меченого и очищенного рибозонда. Перед началом гибридизации с использованием криостата соберите два или три среза мозга на предметные стекла Superfrost Plus.

Толщина среза должна составлять 10–12 мкм. Слайды можно хранить при температуре -80 °C до момента использования. Инкубируйте срезы в холодном свежеприготовленном 3% растворе параформальдегида в течение пяти минут.

Затем кратко промойте срезы дважды в PBS. Далее дегидратируйте срезы с помощью стандартной серии спиртовых растворов (70, 95 и 100% этанола) по две минуты в каждом растворе. После дегидратации инкубируйте срезы в свежеприготовленном растворе для ацетилирования в течение 10 минут.

Затем промойте срезы трижды в 2× SSPE и повторно дегидратируйте их после ацетилирования, используя стандартную серию спиртов, как показано выше. Теперь приступайте к гибридизации с рибозондом. Нанесите соответствующий объем раствора для гибридизации на ткань, накройте предметные стекла покровными стеклами и поместите их в металлический держатель для предметных стекол.

Погрузите держатель в ванну с минеральным маслом, нагретую до 65 °C, на ночь. На следующий день осторожно извлеките держатель для предметных стекол из масляной ванны и кратко промойте его в хлороформе, чтобы удалить излишки масла с предметных стекол.

Поместите предметные стекла в 2-кратный раствор SSPE на 5–10 минут, чтобы удалить покровное стекло. После снятия покровного стекла перенесите предметные стекла в свежий 2-кратный раствор SSPE и выдержите их в течение одного часа при комнатной температуре; в начале этого этапа инкубации предварительно нагрейте раствор 2-кратного SSPE с 50% формальдегидом до той же температуры, что и при гибридизации. По завершении одночасовой инкубации перейдите к следующему этапу.

Перенесите предметные стекла в предварительно нагретый раствор 2х SSPE для гибридизации и инкубируйте в течение 1,5 часов. В начале этого этапа инкубации предварительно нагрейте раствор 0,1х SSPE до той же температуры, что и на этапе гибридизации. Завершите промывки после гибридизации, перенеся предметные стекла в предварительно нагретый раствор 0,1х SSPE, и инкубируйте в течение 30 минут.

Повторите эту промывку один раз. Срезы мозга теперь готовы к детекции и визуализации гибридизованных рибозондов; добавьте 0,3% перекиси водорода в буфер TNT и инкубируйте предметные стекла в этом растворе в течение 10 минут. Затем промойте стекла в буфере TNT трижды по 10 минут каждый раз, используя deco pen.

Нарисуйте вокруг области со срезами мозга ограничительный круг. Нанесите по 150 µL буфера TNB на каждое стекло и инкубируйте срезы в этом растворе в течение 30 минут. Следите за тем, чтобы срезы не пересохли на данном этапе.

Затем нанесите 150 µL раствора TT NB, содержащего антитела к DIG, конъюгированные с пероксидазой, и выдержите предметные стекла во влажной камере в течение двух часов. По истечении двухчасовой инкубации промойте срезы в буфере TNT трижды по 10 минут. Каждый раз наносите на каждое предметное стекло по 150 µL рабочего раствора T IDE, конъюгированного с Alexa 5 9 4, и выдержите стекла во влажной камере в течение одного часа.

По истечении одного часа трижды промойте срезы в буфере TNT по 10 минут. После каждой промывки инкубируйте срезы в растворе 0,3% перекиси водорода в буфере TNT в течение 10–30 минут. Время инкубации в растворе перекиси водорода зависит от содержания мРНК и должно быть определено опытным путем перед проведением D fish.

Затем трижды промойте срезы в буфере TNT по 10 минут за каждую процедуру. Нанесите по 150 µL буфера TMB на каждый слайд и выдержите слайды в увлажненной камере в течение 30 минут. Удалите излишки раствора TMB, наклонив слайды.

Добавьте 150 µL раствора TMB, содержащего антитела к анину, конъюгированные с пероксидазой, и выдержите стекла во влажной камере в течение двух часов. Затем трижды промойте срезы в буфере TNT по 10 минут. Каждый раз наносите на стекла 150 µL рабочего раствора Alexa 488-конъюгированного мита и инкубируйте срезы в течение одного часа.

Затем промойте срезы в буфере TNT трижды по 10 минут. После того как оба рибозонда будут помечены антителами, инкубируйте срезы в 150 µL раствора носителя в течение двух минут. Затем промойте срезы в буфере TNT трижды по пять минут, нанесите на срезы совместимую с флуоресценцией среду для заключения, такую как Vector Shield или Prolong Antifade, накройте покровным стеклом и исследуйте под флуоресцентным микроскопом.

Данные репрезентативные микрофотографии получены в ходе эксперимента D fish на срезах головного мозга зебровой амадиньи, в частности, из области NCM — аналога слуховой коры млекопитающих у певчих птиц. Срезы мозга были гибридизированы с двумя зондами: биотинилированным рибозондом против par albumin, маркера субпопуляции тормозных нейронов, и рибозондом с меткой DIG против активности-зависимого гена zinc, надежного маркера нейронов, активируемых пением. Наложение двух изображений демонстрирует популяцию тормозных нейронов, которые активируются под воздействием слухового опыта.

Стрелки указывают на клетки, меченные исключительно рибозондом к par. Стрелки альбумина указывают на клетки, меченные исключительно зондом RIBA к цинку, представляющие собой нейроны. Клетки, коэкспрессирующие оба интересующих транскрипта, отмечены звездочкой. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать чистоту рабочего места и использовать безнуклеазные растворы, пластиковую посуду и стеклянную посуду.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как одновременно детектировать два вида мРНК с разрешением до одной клетки в свежезамороженных срезах мозга для изучения корегуляции генов в мозге крысы. Благодарим за просмотр видео. Желаем удачи в ваших экспериментах.