Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

Общая цель этой процедуры заключается в создании органотипических культур срезов гиппокампа, которые могут быть использованы для моделирования повреждения нейронов в ответ на различные стимулы, включая NMDA, эксайтотоксичность кислорода, депривацию глюкозы или воспалительные стимулы, такие как липополисахарид или бета-амилоидный пептид. Это достигается путем первичной изоляции постнатального мозга и разрезания каждого полушария для создания корональных суков. Вторым этапом процедуры является изоляция областей гиппокампа и культивирование их на мембранных вставках в шести луночных планшетах После культивирования срезов срезы окрашивают йодидом пропидия и рассчитывают уровень спонтанной гибели нейронов.

Наконец, срезы обрабатывают нейротоксическим агентом и окрашивают для измерения токсичности на лечение. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают процент гибели нейронов в CA one, CA three и зубчатых областях гиппокампа в экспериментальных условиях путем количественной оценки флуоресценции пропидия йодида с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Основным преимуществом метода наименьшего развития по сравнению с существующим скрягой, таким как первичная культура нейронов, является исследуется механизм повреждения нейронов, при котором основная архитектура гиппокампа относительно неповреждена.

И к третьему типу относятся физические упражнения. Микроглия и ROY сохраняются до начала вскрытия. Вставьте в каждую проницаемую для миллипор мембрану.

Ну и добавьте по одному миллилитру питательной среды в каждую лунку из нескольких. Шесть луночных планшетов для культивирования тканей. Прогрейте тарелки в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию.

Ненадолго окуните обезглавленную голову семи крысиных детенышей в 70% этанол. Для его дезинфекции используются микрорассекающие ножницы, чтобы сделать сагиттальный разрез через череп, чтобы обнажить мозг. С помощью щипцов быстро удалите мозг и перенесите его в 60-миллиметровую посуду с препарирующей средой на лед.

Используйте щипцы, чтобы разделить мозг на два полушария. Положите каждую полусферу медиальной стороной вниз на сухую губку на две-три секунды, чтобы собрать лишнюю влагу. Перенесите мозг в квадрат клеарной пленки и поместите его на платформу тканевого измельчителя на корональный срез в 350 микронных сечениях, начиная с росланда.

И продолжаю нянчиться. Аккуратно поднимите квадрат A clar и погрузите ломтики в свежую посуду с ледяной средой для препарирования. Под вскрытием микроскопа определите гиппокамп, структуру-форму CS, лежащую ниже коры головного мозга, прижатую к стриатуму.

Используйте щипцы, чтобы отделить гиппокамп от каждого коронарного отдела. С помощью пастеровской пипетки, модифицированной, как описано в тексте, перенесите пять срезов гиппокампа на каждую мембрану. Вставьте в подготовленные теплые шесть лунок пластины.

Удалите излишки среды с поверхности мембраны. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 12-14 дней. Сменив среду, как описано в сопроводительном тексте, после 12-14 дней в культуре замените среду и добавьте пять микрограммов на миллилитр йодида пум, сокращенно пи, чтобы обеспечить визуализацию и количественную оценку гибели базальных клеток.

Инкубируйте срезы в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе под инвертированным флуоресцентным микроскопом, подключенным к ПЗС-камере. Точечный захват флуоресценции PI, соответствующей базальному уровню гибели клеток, в момент времени, равный нулю часов или нулю T, сразу после визуализации. Срезы вызывают повреждение нейронов с помощью предпочтительного метода для данного эксперимента.

Здесь срезы инкубируются со свежей средой, содержащей 10 микромолярных NMDA, в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После нейротоксического лечения. Замените среду свежей питательной средой, содержащей пять микрограммов на миллилитр пи.

Инкубируйте срезы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом углекислом газе после нейротоксического лечения. Средние измерения флуоресценции для этого момента времени представляют собой уровни гибели клеток. Через 24 часа после экспериментального повреждения или через 24 часа Т немедленно замените среду свежей питательной средой, содержащей 10 микромолярных NMDA и пять микрограммов на миллилитр.

PI инкубируют срезы в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе для достижения максимальной гибели нейронов. Получите окончательный набор изображений ПИ флуоресценции, средние измерения флуоресценции для этого момента времени. Представляют максимальные уровни гибели клеток или Tmax.

Количественно оцените флуоресценцию PI в интересующей области с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано в сопроводительном тексте. Это репрезентативное изображение окрашивания ПИ базальной нейрональной смерти в примерно одной области гиппокампа. Вот репрезентативное изображение смерти нейронов, окрашенных ПИ.

Через 24 часа после часовой обработки 10 микромолярных NMDA обратите внимание на более интенсивное окрашивание, указывающее на более высокую степень гибели клеток. На этом изображении показано максимальное окрашивание PI после ночной инкубации с 10 микромолярными NMDA. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать органический срез гиппокампа и измерить уровень повреждения нейронов.