Производство биологически Производные инъекций Материалы для тканевой инженерии миокарда

Матриксные гели, полученные из децеллюляризированной ткани перикарда и миокарда, сохраняют нативные компоненты внеклеточного матрикса, включая различные белки, пептиды и гликозаминогликаны. Такие тканевые матриксы могут быть использованы в тканевой инженерии. В данном видео продемонстрирован способ изготовления матриксных гелей путем децеллюляризации ткани перикарда для получения ацеллюлярного внеклеточного матрикса.

Затем внеклеточный матрикс подвергается обработке для получения растворимой жидкой формы. Далее растворенный матрикс тестируется на модели мелких животных для определения возможности его применения в качестве инъекционного каркаса. Гистологический и иммуногистохимический анализы показывают, что in vivo введенный материал образует пористый волокнистый каркас, обеспечивающий инфильтрацию сосудистых клеток.

Здравствуйте, меня зовут Соня Зеки. Я аспирантка в лаборатории доктора Карен Крисман в Калифорнийском университете в Сан-Диего. Сегодня мы подготовим растворимый внеклеточный матрикс (ECM) из децеллюляризированной ткани и продемонстрируем тестирование in vivo для применения в инженерии сердечной ткани.

Эти методы имеют важное значение для разработки терапии на основе инъекционного биоматериала для лечения сердечной недостаточности. Демонстрацию хирургической процедуры после инфаркта миокарда проведет Пэм Шу Макгаффин, ветеринарный нейрохирург нашей лаборатории. Итак, приступим.

Начните выполнение данного протокола с децеллюляризации ткани для получения только внеклеточного матрикса (ВКМ). Сначала поместите свиной перикард в стакан с деионизированной водой и промывайте его при перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывки поместите ткань в 1× PBS, содержащий 1% SDS и 1% пенициллина-стрептомицина; перемешивайте непрерывно в течение 24 часов при комнатной температуре. На следующий день верните ткань в деионизированную воду и перемешивайте непрерывно в течение пяти часов, встряхивая пробирку объемом 50 мл до полного исчезновения пены.

Окрашивание гематином и эозином должно подтвердить отсутствие ядер в децеллюляризированной ткани. Поместите оставшуюся часть децеллюляризированной ткани в коническую пробирку объемом от 15 до 50 мл. Затем поместите ткань в морозильную камеру при температуре -80 °C.

Лиофилизируйте замороженные образцы путем сублимационной сушки при очень низком давлении и очень низкой температуре до полного высыхания. В зависимости от используемой системы и содержания воды в образцах этот процесс может занять от 12 до 72 часов. После полного высыхания децеллюляризированной ткани перенесите её в мельницу Wiley Minim.

Используя сито с ячейками 40 гейдж, перетрите ткань в мелкий порошок. После того как большая часть образца пройдет через фильтр, извлеките сборный стакан. Полученный образец далее именуется порошком внеклеточного матрикса или ECM-порошком.

Если переход к следующему этапу не осуществляется немедленно, в данный момент может быть проведена вторая лиофилизация. Это обеспечит точность измерения веса при растворении ECM. Отвесьте необходимое количество порошка ECM в стерильный флакон для разведения.

Добавьте в сцинтилляционный флакон с порошком ВКМ стерильно отфильтрованный раствор хлористого водорода с концентрацией 1 мг/мл Pepcid так, чтобы концентрация ВКМ составила 10 мг/мл. Добавьте магнитный перемешиватель и установите флакон на магнитную мешалку.

Перемешивайте постоянно в течение 48–60 часов, периодически соскребая содержимое со стенок флакона стерильной ложкой или шпателем WHE. Это необходимо для обеспечения полного переваривания порошка ECM. По мере переваривания ECM будет переходить в раствор.

После сольватации ВКМ поместите образец на лед и доведите pH до 7.4, используя гидроксид натрия и соляную кислоту. После корректировки pH добавьте 10-кратный PBS так, чтобы итоговая концентрация раствора составила 1-кратный PBS. Например, если у вас имеется 900 µL раствора ВКМ, после корректировки pH следует добавить 100 µL 10-кратного PBS.

Определите концентрацию раствора солюбилизированного ВКМ, подсчитав объемы, добавленные для нейтрализации, и объемы, изъятые для проверки pH. Затем добавьте PBS в объеме, равном объему раствора, чтобы достичь здесь желаемой конечной концентрации. Шесть mg/mL.

В день операции приготовьте инъекцию 75 µL растворенного ECM в шприце объемом 0,1 mL с иглой 30G. Поддерживайте анестезию интубированной самки крысы линии Harlan dolly с помощью 2,5% изофлурана. После этого проверьте глубину анестезии, проведя щипковый тест пальца лапы.

Для гидратации подкожно введите в нижнюю часть живота три миллилитра раствора Рингера-лактата. Затем поместите животное на операционный стол в положение на спине и осторожно зафиксируйте конечности с помощью ленты. С помощью триммера удалите шерсть на животе и уберите свободные волоски с помощью вакуумного аспиратора.

Сделайте серию инъекций 2% лидокаина по 50 µL по диагонали от мечевидного отростка к нижней правой стороне брюшной полости. Затем трижды обработайте область Бетадином, двигаясь от центра к периферии. Повторите очистку с использованием изопропилового спирта.

Затем накройте животное хирургической салфеткой с готовым круглым окном. Зафиксируйте хирургической салфеткой. Используйте скальпель № 10.

Сделайте разрез длиной от трех до четырех сантиметров от мечевидного отростка до нижней правой стороны брюшной полости. Найдите мечевидный отросток и проведите вертикальное расслоение мышц вниз и вправо, стараясь не повредить крупный сосуд справа. Затем с помощью ножниц выполните латеральный разрез мышц, чтобы обнажить диафрагму.

Осторожно избегайте повреждения печени, используя шовный материал Vicryl 3-0 длиной 36 дюймов и пару гемостатов. Проведите иглу через мечевидный отросток и вытяните нить наполовину. Скрепите концы нити лентой и зафиксируйте их в точке над животным и позади него, приподняв мечевидный отросток и обнажив диафрагму с помощью другого отрезка шовного материала Vicryl 3-0 длиной 36 дюймов.

Проведите иглу через мышцу, ближайшую к мечевидному отростку, затем снова вытяните её и зафиксируйте конец в другой точке справа от операционного стола, полностью открывая операционную полость. Далее, используя маленькие микропинцеты типа «зуб крысы», захватите центр диафрагмы, вытяните её и сделайте очень небольшой разрез тупыми ножницами. После того как отверстие будет сделано, легкие сократятся.

Сделайте вертикальный разрез диафрагмы длиной два-три сантиметра, чтобы обнажить сердце. Затем вставьте тампон длиной три дюйма слева от полости и отодвиньте легкие. Зафиксируйте тампон с помощью зажима для полотенец.

Используя другой тампон, отодвиньте правую долю легкого, чтобы обнаружить перикардиальный мешок. Затем с помощью микропинцета и большого зубчатого пинцета прорвите перикардиальный мешок, обнажая верхушку сердца. Захватите верхушку сердца правым зубчатым микропинцетом и введите иглу для инъекции растворенной матрицы срезом влево.

На расстоянии одной трети от верхушки параллельно поверхности эпикарда. Обязательно избегайте попадания в большую венечную вену. Введите раствор матриксного геля и подождите несколько секунд перед извлечением иглы.

В месте инъекции ткань должна побелеть; удалите кровь из полости, затем с помощью изогнутых микрогемостатов снимите зажим для полотенец и тампон, удерживающий правое легкое. Завяжите первый узел, используя нить из пролина 5-0 длиной 30 дюймов. Затем с помощью микропинцета с зубцами для крыс зашейте диафрагму непрерывным швом с использованием конической иглы до полного закрытия. Вставьте аспирационную трубку PE 1 60 и затяните вокруг нее, используя шприц объемом 10 мл для эвакуации содержимого грудной полости.

При затягивании шва диафрагма должна быть вогнутой. Снизьте концентрацию фтора до 1%. Извлеките оба шва Vicryl 3-0, удерживающие полость открытой. Увлажните мышцу, удалив излишки тампоном или стерильной марлей.

Используйте новый отрезок шовного материала 3-0 для ушивания мышечного слоя прерывающимими швами. Затем выключите подачу изофлурана. Очистите область операционного поля и закройте кожу с помощью скоб.

Затем нанесите тройную антибиотическую мазь на место разреза. Дайте крысе восстановиться при подаче 100% кислорода. Когда животное начнет дышать самостоятельно, извлеките трахеальную трубку.

Как только животное восстановит координацию движений, введите подкожно анальгетик бупренорфина гидрохлорид в дозе 0,05 мг/кг и поместите его обратно в домашнюю клетку на стерильное полотенце. Ткань сердца крыс, которым вводили растворимые матриксные гели, подвергали секционированию и окрашивали гематоксилином и эозином для общего гистологического анализа в различные моменты времени. После операции на ранних этапах область инъекции выглядит как розовая фиброзная сеть, которая на более поздних этапах распространяется в интерстициальном пространстве.

Спустя две недели наблюдается приток клеток. Замечается деградация введенного матрикса. Если внеклеточный матрикс (ECM) был помечен биотином перед инъекцией, его можно визуализировать более непосредственно, окрашивая биотин с помощью конъюгата стрептавидина с HRP, чтобы увидеть врастание и формирование сосудов в области введения матрикса.

Данные срезы были подвергнуты двойному окрашиванию. Конъюгированный селектин, который связывается с эндотелиальными клетками, показан зеленым цветом, а антитело к гладкомышечному актину — красным. Стволовые клетки также могут быть обнаружены вблизи области инъекции.

Здесь они были визуализированы с помощью иммуногистохимического окрашивания на C kit. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать солюбилизированный ВКМ из децеллюляризированной ткани и тестировать его in vivo для применения в области инженерии сердечной ткани. Не забывайте, что, хотя в данном случае мы используем ткань перикарда, эту общую процедуру можно модифицировать для использования с любым другим источником тканей.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.