Исследование глиальных Влияние неоднородности сотовый на рост Axon Использование нового метода Coculture

Общая цель данной процедуры заключается в изучении влияния гетерогенности глии на рост аксонов и дифференцировку клеток DRG. Для этого сначала выделяют глиальные клетки из коры головного мозга новорожденных крыс. Вторым этапом процедуры является культивирование и очистка нейронов DRG эмбриона крысы.

Третьим этапом процедуры является высев очищенных нейронов DRG на клетки глии. Заключительный этап процедуры заключается в наблюдении за ростом аксонов, проведении окрашивания клеток и количественного анализа. В итоге можно получить результаты.

В данном видео с помощью таймлапс-записи и иммунофлуоресцентной микроскопии демонстрируется влияние гетерогенных глиальных клеток на рост нейронов DRG. Здравствуйте, я представляю лабораторию нейровизуализации кафедры неврологии UCRA. Сегодня мы представим вам методику изучения гетерогенного влияния глиальных клеток на рост в новом методе культуры нейронов.

В нашей лаборатории мы используем этот новый метод для изучения взаимодействия между нейронами и глиальными клетками. Перейдем к исследованию. Чтобы создать кокультуру глиальных клеток и нейронов спинномозговых ганглиев (DRG), мы начнем с культивирования глиальных клеток в ламинарном шкафу. На дно предварительно стерилизованных 24-луночных культуральных планшетов поместите стерилизованные круглые стеклянные покровные стекла; затем покройте покровные стекла в лунках 6-луночного культурального планшета полилизином и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре.

Промойте покровные стекла и культуральные планшеты дважды дистиллированной водой и высушите на воздухе. Затем внесите пипеткой 200 µL или 2 мл модифицированной среды Игла (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в каждый луночный планшет на 24 или 6 лунок соответственно. Инкубируйте планшеты при 37 °C в атмосфере 5% CO2 до следующего дня.

Стерилизуйте бокс для диссекции с положительным потоком воздуха. Включите УФ-лампу на 20 минут, затем обработайте все поверхности внутри бокса 70% ethanol и подождите 15 минут перед началом работы. Начните с голов двух крысиных щенков в возрасте от P2 до P6, которые были анестезированы путем гипотермии.

Затем проведите декапитацию у основания большого затылочного отверстия с помощью операционных ножниц. Вскройте череп вдоль сагиттального шва, используя ирисовые ножницы, и снимите свод черепа. Извлеките передний мозг, поместите его в охлажденный раствор Levo Wit's L 15 и повторите процедуру со второй головой.

Затем, работая под стереомикроскопом, осторожно удалите твердую мозговую оболочку, а также пленки и кровеносные сосуды, покрывающие мозг. Изолируйте кору и несколько раз промойте её средой L 15.

С помощью микрохирургических ножниц разрежьте кору на мелкие фрагменты. Затем инкубируйте в среде L 15, содержащей 0,125%трипсина в EDTA, при 37 °C в течение 15 минут. После этого перенесите блоки ткани в пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл среды DMEM с 20%FBS.

Добавьте DS до конечной концентрации 10 µg/mL. Затем с помощью пастеровской пипетки с оплавленным концом перемешайте раствор ткани примерно 20 раз для разделения клеток. В завершение один раз промойте клетки средой DMEM, содержащей 10% FBS, и определите количество клеток с помощью гемоцитометра.

Затем произведите посев клеток с плотностью от 5,000 до 10,000 клеток на квадратный сантиметр и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. Для изоляции, очистки и культивирования DRG заменяйте среду дважды в неделю. Сначала подготовьте 24-луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами, покрытыми полилизином, как было показано ранее.

Добавьте по 100 µL среды NVF на каждое покровное стекло и инкубируйте планшеты при 37 °C до следующего дня. Стерилизуйте положительный ламинарный шкаф, как описано ранее. Затем возьмите эмбрионы крыс стадий E 12 – E 15, которые были извлечены из матки беременной крысы, эвтаназированной с помощью углекислого газа, под стереомикроскопом.

Изолируйте спинной мозг вместе с присоединенными ганглиями задних корешков и перенесите их в чашки диаметром 35 мм, содержащие охлажденную среду L 15. С помощью микрохирургического пинцета осторожно отделите присоединенные DRG от спинного мозга в охлажденной среде L 15, стараясь не повредить DRG; перережьте присоединенные аксоны.

Обычно из одного спинного мозга изолируют от 20 до 30 DRG, когда все DRG уже извлечены из спинных мозгов. Все изолированные DRG помещают в 0,125% раствор трипсина в EDTA и инкубируют в течение 20 минут при 37 °C и 5% CO2. Клетки промывают один раз средой DMEM с 20% FBS, затем добавляют DNAs и несколько раз пропипетируют, используя огнеполированную пастевскую пипетку, для получения однородной клеточной суспензии, как это было продемонстрировано с глиальными клетками. Выполняют второе промывание в среде MBF, подсчитывают клетки, затем высевают их на подготовленные покровные стекла в 24-луночных планшетах из расчета 5 000 клеток на лунку; инкубируют в течение ночи для очистки нейронов DRG.

Через 18–24 часа после посева замените среду на нейробазальную среду, содержащую 20 µM 5-фтор-2'-дезоксиуридина. Через 72 часа замените половину среды на нейробазальную среду без FUDR.

Затем среду заменяют через день. Примерно через 20 дней после посева глиальные клетки достигнут конфлюэнтности и будут готовы к совместному культивированию с нейронами за 24 часа до объединения двух типов клеток.

Замените среду для глиальных клеток на среду MBF. Подготовьте суспензию единичных клеток очищенных DRG, как было показано ранее. Определите плотность клеток.

Затем высейте нейроны на глиальные клетки с плотностью 500 клеток на квадратный сантиметр. Приживаемость нейронов и рост нейритов на глиальных клетках можно анализировать в различные моменты времени с помощью программного обеспечения для анализа изображений и иммунохимического окрашивания с использованием антител, специфичных для данного типа клеток. Ниже приведены примеры глиальных клеток и нейронов DRG, культивируемых раздельно и в виде кокультуры; глиальные клетки становятся конфлюэнтными через 20 дней.

В культуре. При исследовании с помощью фазово-контрастного микроскопа стало очевидно, что различные субпопуляции глиальных клеток формируют разные паттерны роста и морфологию. Методом иммуноцитохимии было установлено, что GFAP-положительные астроциты составляют более 90% культуры.

При использовании нашего метода обработки FUDR в течение 72 часов чистота нейронов DRG достигнет 99% в течение шести дней; при этом в кокультуре нейронов и глиальных клеток они будут демонстрировать свою уникальную морфологию с высокой плотностью роста нейритов. Прикрепление нейронов DRG и рост нейритов на глиальных клетках происходили легко в течение четырех часов после посева; прикрепление нейронов и рост нейритов зависели от субпопуляций глиальных клеток, которые формируют особые структурные паттерны роста, легко идентифицируемые под фазово-контрастным микроскопом. С помощью иммуноцитохимического анализа я продемонстрирую вам, как культивировать нейроны DRG с глиальными клетками для изучения влияния гетерогенности глиальных клеток на рост нейронов.

При выполнении данной процедуры крайне важно очень осторожно обращаться с тканью и поддерживать клетки в среде. Никогда не подвергайте их воздействию воздуха и не допускайте их высыхания. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.