Электронного парамагнитного резонанса Микро-изображения живых видов карт для использования с кислородом

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении трехмерных изображений концентрации кислорода в непосредственном окружении живых клеток с микронным разрешением с помощью микроскопии электронного спинового резонанса (ЭСР). Протокол будет продемонстрирован на примере цианобактерий, которые являются типичными фотосинтезирующими клетками. Для этого сначала подготавливают образец клеток цианобактерий внутри держателя образцов для ЭСР-микроскопии.

Образец помещен в стабильный раствор органического радикала. Держатель образца помещают внутрь зонда для визуализации, который вводится в статический электромагнит системы ЭПР-микроскопа. Затем с помощью ЭПР-микроскопа получают несколько трехмерных ЭПР-микроизображений раствора органического радикала.

Это выполняется для нескольких вариантов импульсных последовательностей и часто при различных внешних условиях, например, на свету и в темноте. Затем компьютер обрабатывает изображения с необработанными данными для извлечения трехмерно пространственно-разрешенных времен релаксации радикала. Эти времена релаксации позволяют напрямую определить концентрацию кислорода с помощью предварительной калибровки, что ведет к получению полных трехмерных карт распределения кислорода в измеряемых образцах при различных внешних условиях.

Полученные результаты четко демонстрируют отсутствие продукции кислорода цианобактериями в отсутствие света. Кроме того, показано, что при световом облучении вблизи клеток цианобактерий создаются значительный градиент кислорода и гетерогенность его распределения. Здравствуйте, я — Ал из лаборатории BLA химического факультета Техниона, Израильского технологического института в Хайфе.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру трехмерного картирования концентрации кислорода вблизи живых клеток с высоким пространственным разрешением с помощью микроскопии ближнего поля. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения скорости потребления кислорода и метаболической активности клеток. Итак, приступим.

Электронный спиновый резонанс или ЭСР — это спектроскопический метод, основанный на поглощении электромагнитного излучения определенной частоты парамагнитными частицами с неспаренным электронным спином, помещенными в внешнее статическое магнитное поле. Это мощный метод изучения окружения парамагнитных молекул в живых организмах, включая определение концентрации кислорода и активных форм кислорода. Здесь представлено типичное изображение распределения концентрации кислорода в опухоли мыши для гетерогенных образцов.

Спектральную информацию ЭСР можно получить с пространственным разрешением с помощью градиентов магнитного поля. В мышь вводили стабильный свободный органический радикал, и характеристики его ЭСР позволяют определить концентрацию кислорода в окружающей среде. Результаты, основанные на ЭСР, накладываются на анатомическое МРТ-изображение.

До настоящего времени подобные методы ЭПР-визуализации живых образцов проводились только на относительно крупных объектах миллиметрового масштаба. ЭПР-микроскопия высокого разрешения предполагает измерения образцов миллиметрового и субмиллиметрового размера, что позволяет получать трехмерные ЭПР-изображения с разрешением, приближающимся к одному микрону.

Ниже представлены два примера ЭПР-изображений с микромасштабным разрешением: сгенерированный образец с порошком NNC 60 и парамагнитные кристаллы цианида лития. ЭПР-микроскоп по своему устройству схож с обычным ЭПР-спектрометром: он имеет магнит для создания статического поля, микроволновую систему для возбуждения спинов и детектирования сигнала, зонд для фиксации образца и компьютерную консоль для управления процессом сбора и обработки данных. В состав системы также входят драйверы градиента магнитного поля, являющиеся частью электронной системы, и градиентные катушки, расположенные в визуализирующем зонде.

Градиентные катушки также имеют апертуру для обеспечения облучения образца светом. На образец подается увлажненный воздух с контролируемой температурой для минимизации дегидратации в ходе эксперимента. Основными уникальными особенностями ЭПР-микроскопии являются малый размер зонда и градиентных катушек, повышенная спиновая чувствительность системы и высокая мощность драйверов градиента магнитного поля. Перед началом данной процедуры приготовьте суспензию цианобактерий в концентрации 40 mg/mL.

Для начала подготовки образцов для микровизуализации методом ЭПР с помощью тонкого пинцета возьмите несколько квадратов абсорбирующей бумаги размером примерно 400 на 400 микрон. Затем поместите их в пробирку типа «эппендорф». После этого заполните пробирку 1,2 миллилитрами суспензии цианобактерий.

Затем центрифугируйте суспензию в микроцентрифуге в течение двух минут при 6 000 RPM. После центрифугирования полностью удалите супернатант, оставив примерно 50 µL, чтобы избежать дегидратации цианобактерий. В результате этого процесса абсорбирующая бумага насыщается клетками цианобактерий. Далее подготовьте специальный чашеобразный держатель для образцов, извлеките несколько волокон из бумаги с помощью тонкого пинцета и поместите их на дно держателя образца.

После этого с помощью шприца объемом 8 мкл добавьте 3 мМ раствор tridel и раствор BG 11, приготовленный согласно описанному в письменном протоколе методу. Затем герметизируйте держатель образца с помощью УФ-отверждаемого клея, нанося его между краями стеклянного держателя образца и соответствующим ему покровным стеклом, оставив небольшое отверстие для выхода воздуха. В завершение отвердите клей под воздействием УФ-излучения в течение двух секунд.

Для начала эксперимента по визуализации включите систему микро-ЭПР-визуализации и поместите образец в резонатор, расположенный внутри зонда для визуализации. Затем с помощью управляющего программного обеспечения переведите систему в режим настройки и определите резонансную микроволновую частоту зонда, которая будет использоваться для измерений ЭПР. После этого установите значение статического магнитного поля, соответствующее приложенной микроволновой частоте.

Установите временные параметры импульсной последовательности и проследите за сигналом ЭР, чтобы убедиться в исправности системы и надлежащей подготовке образца. Затем установите параметры визуализации, такие как количество пикселей, напряженность градиентов и длительность градиентных импульсов, в соответствии с требуемыми значениями. После завершения настройки получите три 3D-ЭР-изображения с помощью импульсной последовательности Han Echo Imaging с интервалами между импульсами tau, равными 500, 600 и 700 наносекунд.

На данном этапе, если этого требуют условия эксперимента на протяжении всего процесса сбора данных, включите световую проекцию на образец; данные сохраняются автоматически. После завершения процесса сбора данных обработайте файлы с необработанными данными с помощью скрипта в программном обеспечении MATLAB. Используя данное ПО, постройте изображения концентрации трилльного радикала и времени релаксации.

Значения T₂ mapping затем преобразуют данные изображения в изображение концентрации кислорода с помощью существующей калибровочной кривой, связывающей концентрацию кислорода со временем релаксации. Здесь T₂₀ представляет собой время спин-спиновой релаксации зонда в аноксических условиях, которое зависит от концентрации зонда C и его коэффициента диффузии D. Представлены типичные исходные изображения из нескольких экспериментов по трехмерной ЭСР-томографии цианобактерий. Эти изображения были получены при различных значениях tau как в темноте, так и при освещении.

В темноте результаты очень схожи, за исключением снижения интенсивности при больших значениях T из-за времени спиновой релаксации T₂. И наоборот, при облучении светом структура изображения меняется из-за различий во временах релаксации в разных частях образца. Затем эти данные обрабатываются для получения изображения амплитуды на основе данного снимка.

Очевидно, что цианобактерии сосредоточены преимущественно в правой части держателя образца. Два изображения переводятся в значения концентрации кислорода с помощью предварительно построенного калибровочного графика, связывающего концентрацию кислорода со временем релаксации. Результаты представлены для цианобактерий в присутствии и при отсутствии света.

Очевидно, что выработка кислорода инициируется светом и вызывает значительное увеличение концентрации кислорода в растворе. Это приводит к снижению уровня радикала T2, главным образом в вокселях, расположенных вблизи волокон абсорбирующей бумаги с цианобактериями. Мы только что продемонстрировали вам способ подготовки образца, содержащего живые клетки со стабильным свободным радикалом, для картирования концентрации кислорода методом ЭПР-микроскопии. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости максимально сократить время процесса, чтобы обеспечить стабильность сигнала и избежать деградации образца.

На этом всё. Спасибо за просмотр, и удачи в проведении вашего эксперимента.