Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя

Общая цель этой процедуры заключается в измерении индуцированных лекарственными препаратами изменений свойств бислоя, которые ощущаются бислойными охватывающими белками. Это достигается путем изготовления больших односторонних накладок с фторсодержащим покрытием. Вторым этапом процедуры является опьянение пузырьков грамином.

Третьим этапом процедуры является добавление внешнего гасителя и измерение скорости гашения внутреннего фторсодержащего вещества. Четыре. Заключительным этапом процедуры является количественная оценка изменения фторгашения на каждую активность грамина путем подгонки растянутой экспоненциальной функции к временному ходу флуоресценции. В конечном счете, можно получить результаты, чтобы оценить, могут ли файлы amfi изменять свойства липидного бислоя.

Здравствуйте, меня зовут Ола Андерсон. Здравствуйте, меня зовут Хелсон. Привет, меня зовут Ричи Капо.

Меня зовут Лия Сэнфорд из лаборатории доктора Олафа Андерсона на кафедре физиологии и биофизики в Медицинском колледже Вейла Корнелла. Сегодня мы покажем вам процедуру измерения изменений свойств липидного биослоя. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения влияния лекарственных препаратов и малых молекул на свойства липидных желчных средств.

Итак, давайте начнем В первый день этой процедуры достаньте липиды из морозильной камеры и дайте им сбалансироваться до комнатной температуры. После уравновешивания добавьте 0,6 миллилитра 25 миллиграммов на миллилитр, раствор липидов и хлороформа в 25-миллилитровую колбу с круглым дном. Затем высушите раствор под газообразным азотом, непрерывно вращая колбу, пока весь хлороформ не испарится.

А тонкая белая пленка липидов покрывает всю нижнюю половину колбы, высушивает липиды дальше в влагопоглотителе под вакуумом в течение ночи. Приготовьте раствор из 100 миллимолярной натриевой селитры 25 миллимоляров, А НТС и 10 миллимолярных НЭП рН 7. При регулировке pH этого раствора избегайте любых растворов, содержащих хлориды.

Поскольку таллий Quencher образует нерастворимый комплекс с хлоридом на второй день, регидратируйте липиды за 1,67. Из одного миллилитра этого раствора электролита получается липидная суспензия 10 миллимоляров. Как только будет достигнута правильная концентрация, накройте пара-пленкой и накройте суспензию от света и тщательно защитите образец от света фольгой и дайте ему состариться при комнатной температуре в течение ночи.

На третий день обрабатывайте смесь ультразвуком в течение одной минуты в ультразвуке малой мощности. Затем заморозьте образец в течение пяти минут на сухом льду, затем в течение пяти минут в теплой воде, повторите цикл замораживания и размораживания четыре-пять раз. Выдавите липидную суспензию с помощью мини-экструдера Avanti.

Установите мини-экструдер с поликарбонатным фильтром 0,1 микрона, а опоры фильтра выдавите суспензию вперед и назад 21 раз так, чтобы почти полупрозрачная суспензия оказалась в противоположном шприце, что привело к образованию большой улярной везикулы или суспензии LUV. Удалите внешний A NTS, проведя экструдированную суспензию над колонкой PD 10, которая была уравновешена натриевым буфером. Добавьте в колонку 1,5 миллилитра суспензии LUV плюс один миллилитр натриевого буфера.

После того как раствор будет полностью введен в колонку, разбавьте липосомы тремя миллилитрами натриевого буфера и соберите элюат. Полученный стоковый раствор LUV, наполненный A NTS, должен содержать около четырех-пяти миллимолярных липидов и казаться полупрозрачным. Молочно-белый.

Защитите раствор от света фольгой и храните при температуре 13 градусов Цельсия за 24 часа до использования. Стоковое решение LUV с наполнителем A NTS. Так как НПА имеют плотность более одного грамма на миллилитр или осадок.

Затем разведите наполненный A NTS стоковый раствор LUV. От 1 до 20 с натриевым буфером инкубируют три четверти липосом с 260 нанограммом абидина в ДМСО. Прибавьте такой же объем ДМСО без грамина к оставшейся четверти.

Чтобы поддерживать постоянную концентрацию растворителя во всех образцах, дайте грамину уравновеситься между липидными пузырьками, внутренними и внешними монослоями в течение 24 часов при температуре 13 градусов Цельсия. Здесь для измерения скорости гашения флуоресценции используется прикладной фотофизический спектрофлуориметр SX точка 20 с контролем температуры. Для начала включите приборы на час вперед, чтобы дать возможность прогреть приборы.

Щель с докладчиками для возбуждения должна быть одной косой чертой, а для регистрации излучения с помощью программного обеспечения pro data SX следует использовать фильтр высоких частот 4 55 нанометров. Сначала настройте условия записи, установите длины волн возбуждения монохроматора на 3 52 нанометра. Используйте настройку удержания давления.

Установите время на одну секунду и указывает на 5 000. Отрегулируйте количество повторов до девяти для буферных прогонов и до 13 для прогонов тушителя. Следите за температурой в профиле диска с программным обеспечением Essex.

Объем накопителя должен быть установлен на 120 микролитров, что позволяет смешать 60 микролитров из каждого шприца. Это дает мертвое время примерно в 1,2 миллисекунды. Отрегулируйте высокое напряжение или коэффициент усиления на флуоресцентном детекторе примерно на 420 вольт.

Цель состоит в том, чтобы получить показания флуоресценции около восьми уравновешенных ранее подготовленных A NTS загруженных НПА в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия в темноте. После того, как образец уравновесится, уравновесьте его, затем загрузите его в левый шприц. В правой загрузке шприца либо натриевый буфер, либо таллий. Гаситель.

Удалите пузырьки воздуха, проталкивая шприцы вперед и назад. Оба шприца должны быть заряжены одинаково. Перед закрытием клапанов для самого первого образца зарегистрируйте флуоресценцию с натриевым буфером.

Повторите четыре раза и при необходимости отрегулируйте усиление. Затем повторите еще пять раз для оставшихся образцов. Запишите девять повторов с натриевым буфером.

Замените натриевый буфер на подавитель таллия и запишите 13 повторов. Смойте водой и продолжайте следующий контрольный образец. Включают образцы без грамина и с растворителем, без грамина и с максимальной концентрацией соединения.

А с помощью грамина и растворителя после флуоресцентного анализа считайте данные в программном обеспечении MATLAB для анализа. Для каждой пробы, считанной во всех буферных и гасительных повторах, первые четыре повтора будут загрязнены тем, что ранее находилось в трубке. В этом случае сигнал поступает от смешивания образца натриевого буфера с водой из предыдущей промывки.

Повторы от пяти до девяти представляют собой сигнал только от образца. Поэтому мы всегда исключаем первые четыре повтора в каждом случае. Чтобы избежать артефактов смешивания, вручную просмотрите трассы и удалите все плохие повторы, такие как красная кривая, содержащая пики или отклонения из-за артефактов смешивания и/или пузырьков.

Затем нормализуем повторы гасителя до среднего начального значения буферных повторов для каждой выборки для каждого экспериментального условия, объединяем средние значения всех образцов в один график визуализации, образцы без грамина должны быть одинаковыми и практически не гашать флуоресценцию. Наблюдается медленное снижение флуоресцентного сигнала из-за медленного попадания ионов таллия в везикулы для образцов с грамм-сидином. Если ход времени флуоресценции заметно изменяется под действием соединения, то соединение изменяет свойства липидного бислоя при испытанной концентрации, которая затем подгоняется на растянутую экспоненциальную величину от первых двух до 100 миллисекунд нормализованных кривых гашения флуоресценции.

Для индивидуального повторения и рассчитайте скорость с точностью до двух миллисекунд. Затем вычисляют средние значения и стандартные отклонения для данного образца от индивидуального Повторяют действие капсаицина, обозначенное здесь как колпачок, на временном ходу флуоресцентного гашения при отсутствии или присутствии грамина, обозначаемого как ga, нормированный флуоресцентный сигнал показан здесь в течение одной секунды. Серые точки представляют результаты всех повторов, а красные линии — средние значения.

Показаны первые 100 миллисекунд нормализованного флуоресцентного сигнала. Серые точки являются результатом однократного повторения для каждого условия. Красные линии растянуты в геометрической прогрессии по отношению к этим повторам.

Приглушенная синяя линия обозначает отметку в две миллисекунды. Время, в которое определяется скорость закалки. Относительное изменение скорости гашения определяют путем нормализации данных по контрольному образцу с грамином и без модификатора.

Когда капсаицин всасывается в липидный бислой, он изменяет свойства бислоя. Изменение в сторону более мягкого бислоя будет отражаться как смещение граммовой стороны в равновесии монодимера в пользу проводящего димера. Мы только что показали вам процедуру измерения эффектов возмущения бислоя малой молекулы.

При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что для каждого эксперимента необходимо использовать надлежащие контрольные элементы с использованием одной и той же партии везикул. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.