Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя

Общая цель данной процедуры заключается в измерении изменений свойств бислоя, вызванных воздействием препарата, которые регистрируются белками, пересекающими бислой. Для этого сначала создаются большие односторонние везикулы, нагруженные флуоресцентным красителем. Вторым этапом процедуры является введение грамина в везикулы.

Третьим этапом процедуры является добавление внешнего гасителя и измерение скорости гашения внутреннего флуорофора. Четвертый, заключительный этап процедуры заключается в количественной оценке изменения гашения флуоресценции в зависимости от активности грамина путем аппроксимации временного хода флуоресценции с помощью растянутой экспоненциальной функции. В итоге можно получить результаты для оценки того, способны ли амфифилы изменять свойства липидного бислоя.

Здравствуйте, я Ола Андерсон. Здравствуйте, я Хелсон. Привет, я Ричи Капо.

А я — Лия Сэнфорд из лаборатории доктора Олафа Андерсона на кафедре физиологии и биофизики Медицинского колледжа Вейлл Корнелл. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру измерения изменений свойств липидного бислоя. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения влияния лекарственных препаратов и малых молекул на свойства липидного бислоя.

Итак, приступим. В первый день данной процедуры извлеките липид из морозильной камеры и дайте ему достичь комнатной температуры. После уравновешивания добавьте 0,6 мл раствора липида в хлороформе с концентрацией 25 мг/мл в круглодонную колбу объемом 25 мл. Затем высушите раствор в потоке газообразного азота, непрерывно вращая колбу до полного испарения хлороформа.

Тонкая белая липидная пленка покрывает всю нижнюю половину колбы; дополнительно высушите липиды в эксикаторе под вакуумом в течение ночи. Приготовьте раствор 100 мМ нитрата натрия, 25 мМ ANTS и 10 мМ HEPES с pH 7. При корректировке pH этого раствора избегайте использования любых растворов, содержащих хлориды.

Поскольку на второй день таллиевый гаситель образует нерастворимый комплекс с хлоридом, регидратируйте липиды в 1,67 мл этого электролитного раствора для получения 10 миллимолярной липидной суспензии. После достижения нужной концентрации закройте пробирку парафильмом и тщательно перемешайте суспензию на вортексе, затем защитите образец от света с помощью фольги и оставьте его выстояться при комнатной температуре на ночь.

На третий день обработайте смесь ультразвуком в течение одной минуты с использованием ультразвукового гомогенизатора малой мощности. Затем проведите серию циклов замораживания-оттаивания образца: пять минут на сухом льду, затем пять минут в теплой воде; повторите этот цикл четыре-пять раз. Пропустите липидную суспензию через мини-экструдер Avanti.

Подготовьте мини-экструдер, установив поликарбонатный фильтр с порами 0,1 мкм и опоры для фильтра; пропустите суспензию через фильтр туда и обратно 21 раз, пока в противоположном шприце не окажется почти прозрачная суспензия, что позволит получить суспензию крупных одноламеллярных везикул (LUV). Удалите избыток NTS, пропустив экструдированную суспензию через колонку desalting PD 10, предварительно уравновешенную натриевым буфером. Добавьте в колонку 1,5 миллилитра суспензии LUV и один миллилитр натриевого буфера.

После полного введения раствора в колонку элюируйте липосомы тремя миллилитрами натриевого буфера и соберите элюат. Полученный стоковый раствор LUV, заполненных A NTS, должен содержать около четырех-пяти миллимолярных липидов и иметь полупрозрачный молочно-белый цвет.

Защитите раствор от света с помощью фольги и храните при 13 °C; за 24 часа до использования тщательно перемешайте на вортексе. Сток-раствор LUV, заполненный A NTS. Поскольку UUV обладают плотностью более 1 g/mL, они могут оседать.

Затем разбавьте исходный раствор LUV, заполненных A NTS, в соотношении 1:20 с использованием натриевого буфера. Инкубируйте три четверти липосом с 260 nanogram абидина в DMSO. К оставшейся одной четверти добавьте такой же объем DMSO без грамина.

Чтобы поддерживать постоянную концентрацию растворителя во всех образцах, дайте грамину уравновеситься между внутренним и внешним монослоями липидных везикул в течение 24 часов при 13 °C. Для измерения скорости тушения флуоресценции здесь используется спектрофлуориметр с остановленным потоком Applied Photophysics SX point 20 с контролем температуры. Для начала включите приборы за час до начала работы, чтобы они успели прогреться.

Щель с репортерами для возбуждения должна быть установлена в положение 1/1, а для регистрации эмиссии с помощью программного обеспечения pro data SX следует использовать высокопропускающий фильтр 455 нм. Сначала настройте условия записи, установив длину волны возбуждения монохроматора на 352 нм. Используйте настройку удержания давления.

Установите время на одну секунду, а количество точек — на 5 000. Настройте число повторений: девять для runs буфера и 13 для runs гасителя. Контролируйте температуру в профиле проверки привода программного обеспечения Essex.

Объем подачи следует установить на 120 µL, что соответствует смешиванию по 60 µL из каждого шприца. Это обеспечивает мертвое время примерно 1,2 ms. Настройте высокое напряжение или усиление флуоресцентного детектора примерно на 420 V.

Цель состоит в том, чтобы получить показатель флуоресценции примерно восемь. Инкубируйте предварительно подготовленные UUV, нагруженные A NTS, в течение 10 минут при 25 °C в темноте для достижения равновесия. После этого перемешайте образец на вортексе, затем загрузите его в левый шприц. В правый шприц загрузите либо натриевый буфер, либо Thallium Quencher.

Удалите все пузырьки воздуха, перемещая поршни шприцев вперед и назад. Оба шприца должны быть заправлены в равных объемах. Перед закрытием клапанов для самого первого образца зафиксируйте уровень флуоресценции с использованием натриевого буфера.

Повторите процедуру четыре раза, при необходимости отрегулировав усиление. Затем повторите операцию еще пять раз для остальных образцов. Запишите результаты девяти повторов с натриевым буфером.

Замените натриевый буфер туллиевым гасителем и запишите 13 повторов. Промойте водой и перейдите к контрольным образцам следующего образца. Включите образцы без грамина и с растворителем, а также образцы без грамина с максимальной концентрацией соединения.

После проведения флуоресцентного анализа как для грамина, так и для растворителя, импортируйте полученные данные в программное обеспечение MATLAB для анализа. При считывании данных для всех повторностей с буфером и гасителем имейте в виду, что первые четыре повторности будут загрязнены остатками предыдущего содержимого трубок. В данном случае сигнал возникает из-за смешивания образца натриевого буфера с водой после предыдущей промывки.

Повторы с пятого по девятый представляют собой сигнал только от образца. Поэтому в каждом случае мы всегда исключаем первые четыре повтора. Чтобы избежать артефактов смешивания, вручную просмотрите трассы и удалите все неудачные повторы, такие как красная трасса, содержащая всплески или отклонения, вызванные артефактами смешивания и/или пузырьками.

Затем нормализуйте повторы для гасителя относительно среднего начального значения повторов для буфера для каждого образца при каждом экспериментальном условии; объедините средние значения всех образцов в один график визуализации. Образцы без грамицидина должны быть схожими и демонстрировать почти полное отсутствие гашения флуоресценции. В образцах с грамицидином наблюдается медленное снижение флуоресцентного сигнала из-за постепенного проникновения ионов таллия в везикулы. Если временная кривая флуоресценции заметно изменяется под воздействием соединения, значит, данное соединение при протестированной концентрации изменяет свойства липидного бислоя. Затем подберите растянутую экспоненту к первым 2–100 мс нормализованных кривых гашения флуоресценции.

Выполните отдельные повторности и рассчитайте скорость через две миллисекунды. Затем рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для данного образца на основе отдельных повторностей. Эффект капсаицина (обозначен как cap) наблюдался в ходе кинетики флуоресцентного тушения в отсутствие или присутствии грамина (обозначен как ga); здесь представлен нормированный сигнал флуоресценции за одну секунду. Серыми точками показаны результаты всех повторностей, а красными линиями — средние значения.

Показаны первые 100 миллисекунд нормализованного флуоресцентного сигнала. Серые точки представляют собой результаты одного повторения для каждого условия. Красные линии — это аппроксимации данных повторений с использованием растянутой экспоненты.

Пунктирная синяя линия обозначает отметку двух миллисекунд. Это время, в которое определяется скорость тушения. Относительное изменение скорости тушения определяется путем нормирования данных по контрольному образцу с грамином без модификатора.

При адсорбции капсаицина в липидный бислой изменяются свойства последнего. Переход к более мягкому состоянию бислоя отразится в виде сдвига равновесия мономера и димера в сторону проводящего димера. Мы только что продемонстрировали процедуру измерения эффектов воздействия малой молекулы на структуру бислоя.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования соответствующих контролей для каждого эксперимента с применением одной и той же партии везикул. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.