Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах
25 сентября 2010 г.
Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.
Общая цель этой процедуры заключается во введении одиночных клеток шикарных сомитов или нервных трубок с плазмидой, кодирующей зеленый флуоресцентный белок. Это достигается путем предварительного вытягивания микроинъекционных пипеток с подходящим диаметром отверстия наконечника. Вторым этапом процедуры является подготовка плазмидного запаса к инъекциям.
Третьим этапом процедуры является подготовка эмбрионов к инъекции. Четвертым этапом процедуры является загрузка микропипеток плазмидной ДНК. Завершающим этапом процедуры является введение желаемых тканей.
В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие диапазон производных в числе клеток, продуцируемых одиночными мечеными предшественниками в выбранных сомовых и субдоменах нервной трубки с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Здравствуйте, я Раэль из лаборатории профессора Хейма на факультете медицинской нейробиологии Еврейского университета в Иерусалиме. Сегодня мы покажем вам процедуру введения одиночных клеток куриных сомитов и нервных трубок.
Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения сегрегации линий клеща и клеток нервной трубки. Итак, давайте начнем: чтобы получить одиночные трансфицированные клетки в куриных эмбрионах, начните с вытягивания микропипеток. Мы протягиваем наши пипетки на стандартном съемнике для пипеток Naga PP 83 с нагревом 13,5.
Точная настройка должна быть откалибрована для достижения диаметра наконечника пипетки от восьми до 10 микрон. Мы используем филамент, содержащий трубки из силикатного стекла Бориса, с внешним диаметром один миллиметр и внутренним диаметром от 0,75 до 0,78 миллиметра. Вы также можете использовать коммерчески доступные микропипетки, в которых отсутствует филамент с внешним диаметром один миллиметр и внутренним диаметром 0,75 миллиметра.
Подготовленные пипетки хранятся в пластиковой посуде с наконечниками, защищенными от соприкосновения с краем чашки. Чтобы подготовить ДНК к микроинъекции, представляющую интерес плазмиду трансфицируют в DH five alpha e coli. Используя стандартные процедуры, на следующий день плазмида очищается с помощью набора Maxi для неклональных инъекций, мы используем концентрацию ДНК один микрограмм на микролитр.
Для экспериментов, в которых желательны отдельные клоны, концентрация плазмид будет намного ниже, и ее необходимо будет корректировать. Для P-C-A-G-G-F-P-A хорошо подходит концентрация от 0,05 до 0,1 микрограмма на микролитр. После определения оптимальной концентрации мы рекомендуем разбавлять весь очищенный плазмидный запас, а не отдельные препараты до заданной концентрации.
Последнее может привести к некоторым различиям в показателях успеха, вероятно, из-за различий в чистоте и других параметрах, таких как доля плазмиды суперспирали для подготовки яиц для микроинъекций куриных яиц, которые были инкубированы, лежа на своих длинных осях до желаемой стадии развития, пропитаны 70% этанолом и им дают высохнуть. Далее проткните заостренный конец яйца хирургическими ножницами. С помощью шприца на 10 миллилитров и иглы 19 калибра наберите два миллилитра альбумина из яйца, перед инъекцией запечатайте отверстия горячим парафином.
С помощью хирургических ножниц откройте окно в верхней части яичной скорлупы, чтобы предотвратить попадание мусора в отверстие. Наденьте на окно кусок скотча и прорежьте в нем отверстие. Чтобы помочь визуализировать эмбрион, используйте капилляр, вытягиваемый огнем, установленный на аспираторе, чтобы ввести нетоксичные чернила, такие как пеликан 17, под обработанную кожу.
Затем получите доступ к эмбриону путем разрезания и отведения жизненно важных и/или амниотических оболочек с помощью 0,14-миллиметровых булавок от насекомых, установленных на иглодержателе, чтобы загрузить ДНК в вытянутую пипетку Eloqua и добавить небольшое количество быстрого зеленого порошка с помощью капилляра. Насадите на аспиратор минимальное количество плазмидного капилляра соответствующего диаметра. Затем вставьте его в конец пипетки, противоположный заточенному кончику, и загрузите ДНК как можно ближе к заточенному концу.
Далее прикрепите пипетку к ручному инжектору давления воздуха, установленному на микроманипуляторе. При необходимости приложите минимальное давление, чтобы плазмидный раствор достиг кончика пипетки. Поместите пипетку в жидкую среду яйца, оказывая некоторое давление воздуха, чтобы предотвратить засорение наконечника пипетки.
После того, как соответствующий тканевый домен прокол, изменения давления часто бывает достаточно, чтобы плазмида высвободилась с видимым быстрым зеленым цветом. Если этого не произошло, слегка надавите на шприц до тех пор, пока плазмидная быстрая зеленая смесь не будет выброшена. Повторите эту процедуру вдоль оси эмбриона, после инъекции можно добавить PBS.
Наконец, заклейте окошко липкой лентой и верните яйца в инкубатор. Избегайте вентиляции и включите в инкубатор небольшие емкости с водой, чтобы поддерживать влажность и повысить урожайность. Если целевое место инъекции было достаточно поверхностным, чтобы быть легко видимым, например, в дорсальной нервной трубке или эктодерме, можно измерить вероятность успеха эксперимента, выполнив наблюдение за всей монтировкой с помощью флуоресцентного бинокля.
Этот шаг особенно полезен для оценки того, было ли помечено слишком много или слишком мало клеток. Если желательна дальнейшая инкубация, добавьте в яйцо антибиотики, содержащие раствор PBS, после просмотра и замените потолочную ленту. Кроме того, оценить успешность инъекции можно путем последовательного срезания эмбрионов и проведения иммуногистохимии.
Через четыре часа или более эмбрионы после инъекции фиксируются и обрабатываются для парафинового срезания. Затем срезы, установленные на стекле, дорабатываются и может быть желательна иммуноокрашивание для репортерной визуализации, такие как биотин стрептавидин. Наконец, последовательные срезы сканируются для обнаружения меченых клеток во введенных сегментах.
Если при первоначальных опытах получены множественные, а не одиночные клетки, плазмидный запас должен быть разбавлен в процессе до тех пор, пока не будут достигнуты адекватные результаты. Обычно мы проводим одну инъекцию P-C-A-G-G-F-P на одного клеща, нацеливаясь на от 6 до 12 сегментов на эмбрион. В этих условиях четкий сигнал может быть обнаружен при наблюдении за всей монтировкой, через восемь часов после инъекции, по крайней мере, в одном сегменте одного эмбриона из 10.
В этом примере клещу SO была введена плазмида, кодирующая GFP, и через пять часов одна флуоресцентная клетка наблюдается на изображении эмбриона, показанного здесь. При наблюдении через 24 часа после инъекции в центральный клещ, клон флуоресцентных клеток наблюдается в цельном эмбрионе через два дня после клональной инъекции. Секционирование этого сегмента показывает наличие клонального потомства как в дерме, так и в мышцах, демонстрируя, что отдельные предшественники генерируют оба производных.
Что касается сомитов, то одиночные нейроэпителиальные предшественники в дорсальной нервной трубке также могут быть пронзены, как показано на этом поперечном срезе, сфотографированном через пять часов после инъекции. Анализ серийных срезов показал, что клональный трансфект был достигнут, когда вероятность успеха составляла около 10%. Это означает, что для достижения клональности метод по определению крайне неэффективен. С другой стороны, в этих условиях более 93% положительных событий мечения были признаны клональными.
Мы только что показали вам, как вводить отдельные клетки куриных эмбрионов при выполнении этой процедуры. Важно помнить, что нужно разбавлять большое количество стандартной плазмиды до идеальной концентрации для одноклеточных инфекций, а затем использовать ее во время экспериментов. Вот и все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод инъекции плазмидной ДНК в отдельные клетки сомитов или нервных трубок цыпленка с использованием микропипеток с тонким кончиком. Целью является создание клональных популяций трансфицированных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Генная инженерия
Теоретические основы
- Методы микроинъекций имеют важное значение для изучения функций генов.
- В качестве модельного организма часто используют эмбрионы курицы.
- Для визуализации может быть использована плазмидная ДНК с целью экспрессии флуоресцентных белков.
- Трансфекция единичных клеток позволяет проводить анализ клональных популяций клеток.
Цель исследования
- Разработка надежного метода введения плазмидной ДНК в определенные ткани.
- Получение одиночных трансфицированных клеток для дальнейшего изучения.
- Обеспечение возможности наблюдения за экспрессией генов в живых эмбрионах.
Используемые методы
- Подготовка микроинъекционных пипеток с подходящим диаметром кончика.
- Приготовление стоковых растворов плазмид для инъекций.
- Подготовка эмбрионов цыпленка для микроинъекций.
- Инъекция плазмидной ДНК в сомиты или нервные трубки.
Основные результаты
- Успешное введение плазмидной ДНК в целевые ткани.
- Получение единичных трансфицированных клеток, которые развиваются в клональные популяции.
- Визуализация экспрессии гена с помощью зеленого флуоресцентного белка.
- Разработка протокола для будущих исследований функции гена.
Выводы
- Метод микроинъекций эффективен для трансфекции отдельных клеток.
- Данный метод может быть применен в различных исследованиях в области биологии развития.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения функций генов in vivo.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трансфекция единичных клеток в эмбрионах цыпленка позволяет осуществлять точное отслеживание клеточных линий и генетические манипуляции, что способствует валидации мишеней в путях развития. Данный метод обеспечивает снижение механистических рисков путем установления связи между поведением клеток-предшественников и фенотипическими результатами, что позволяет принимать обоснованные решения на ранних этапах поиска. Его воспроизводимость и количественный клональный анализ повышают прогностическую достоверность в доклинических модельных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания клонального потомства от единичных клеток-предшественников в субдоменах сомитов и нейральной трубки.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации производных типов клеток (например, дермы и мышц), происходящих от меченых предшественников.
- Стратегическая ценность: облегчает отбор приоритетных проектов в портфеле путем сравнения генетически модифицированных клональных популяций с контрольными группами для оценки функциональности мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем спорадической трансфекции единичных клеток в определенных областях ткани.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемой концентрации плазмиды (0,05–0,1 µg/µl для клонального мечения) и согласованных параметров микроинъекций.
- Стратегическая ценность: Повышение эффективности скрининга за счет обеспечения масштабируемого и совместимого с платформой прослеживания клеточных линий в нескольких сегментах эмбриона (6–12 на один эмбрион).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует моделям заболеваний за счет моделирования клональной динамики при эмбриогенезе позвоночных, что актуально для исследования врожденных нарушений.
- Операционная ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации с помощью иммуногистохимии и анализа серийных срезов трансфицированных сегментов.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения по продвижению проекта с учетом рисков путем количественной оценки показателей успеха клонирования (~10% трансфекции, >93% клональности среди положительных образцов) для планирования масштабирования экспериментов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс исследований: от проверки гипотез на ранних этапах изучения биологии до идентификации перспективных соединений посредством клонального функционального анализа и доклинических работ с использованием лонгитюдного отслеживания фенотипа.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая отслеживание линий единичных клеток-предшественников для выяснения диверсификации судеб клеток в линиях сомитов и нервной трубки.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого изготовления микропипеток (диаметр кончика 8–10 µm) и стандартизированных протоколов загрузки ДНК.
- Аналитика: предоставляет количественные данные с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и сканирования срезов для измерения клональной экспансии и вклада производных клеток с течением времени.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя сравнивать манипулированные клональные популяции с контрольными группами в течение трех дней после инъекции.
- Повторное использование в организации: функционирует как многократно используемый метод в различных исследованиях благодаря стандартизированным рабочим процессам подготовки эмбрионов, калибровки пипеток и разведения плазмид.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени, снижение механистической неопределенности в отношениях между линиями.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость трансфекции единичных клеток на различных этапах развития.
- Стратегическая ценность: Обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет раннего клонального фенотипирования.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и принятие решений о продвижении проектов на основе количественных показателей получения клонов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с вытягивателем микропипеток и манипуляциями с эмбрионами для достижения диаметра кончика 8–10 µm и успешного проникновения в ткани.
- Необходимое оборудование включает микроманипулятор, инжектор с пневматическим приводом и флуоресцентный микроскоп для клонального трекинга.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразного разведения плазмид (например, 0.05–0.1 µg/µl) и протоколов стадирования эмбрионов для обеспечения воспроизводимости показателей трансфекции.
- При адаптации метода для различных модельных систем необходимо корректировать давление инъекции и концентрацию ДНК в зависимости от доступности тканей и геометрии эмбриона.
- Практические ограничения включают низкую эффективность трансфекции (~10%), что обуславливает необходимость разведения стокового раствора и повторных инъекций для достижения разрешения на уровне одной клетки.
