Прямой анализ отдельных клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении
4 сентября 2010 г.
Одноместный анализ ячейке осуществляется методом масс-спектрометрии на растительных и животных клеток при атмосферном давлении с помощью заостренной оптическому волокну образец клеток для лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) масс-спектрометрии.
Общая цель следующего эксперимента заключается в извлечении содержимого одной живой клетки и ионизации высвобожденных биомолекул для анализа масс-спектрометром при атмосферном давлении. Это достигается путем выбора отдельной клетки с помощью микроскопа с большим рабочим расстоянием и абляции выбранной клетки лазерным импульсом с длиной волны 2,94 мкм, подаваемым через заостренное оптическое волокно. Абляция одной клетки приведет к образованию микроскопического факела нейтральных частиц, который затем ионизируют.
Поток перехватывается электрораспылителем. Заряженные капли из распылителя объединяются с частицами абляционного факела, исходящего из клетки. В результате образуются капли, содержащие молекулы из клетки, которые генерируют соответствующие ионы.
Полученные результаты демонстрируют масс-спектр одной клетки. Спектр содержит многочисленные пики, соответствующие метаболитам и липидам клетки. Здравствуйте, я доктор Бин Дрестер из лаборатории Verese кафедры химии Университета Джорджа Вашингтона.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру прямого анализа единичных живых клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения метаболитов и липидов единичных растительных и животных клеток. Итак, приступим.
Лазерная абляция с электрораспылительной ионизацией и масс-спектрометрией (LAESI-MS) осуществляется с помощью пятинаносекундного лазерного импульса с длиной волны 2,94 мкм. В данном исследовании для абляции используется перестраиваемый оптический параметрический осциллятор с накачкой от неодимового YAG-лазера.
Для начала закрепите затравленный конец оптического волокна в микроманипуляторе и подведите его вплотную к поверхности клетки. Для эффективного осаждения энергии зажмите незатравленный конец оптического волокна в зажиме для голого волокна для обеспечения оптической юстировки. Зажим для волокна установлен на пятиосевом трансляторе.
Введите лазерную энергию в волокно, фокусируя луч с помощью плосковыпуклой линзы из фторида кальция или линзы из селенида цинка с антибликовым покрытием на его нетравленый конец; для направления луча среднего инфракрасного диапазона на фокусирующую линзу используйте защищенные золотые зеркала. Чтобы поддерживать расстояние между заостренным концом волокна и поверхностью клетки, используйте видеомикроскоп с большим рабочим расстоянием, установленный под углом от 15 до 30 градусов относительно поверхности. Эта система также включает объектив с коррекцией бесконечности и пятикратным увеличением, оснащенный ПЗС-камерой для мониторинга и захвата изображений.
Второй видеомикроскоп установлен под прямым углом к поверхности образца для визуализации клеток сверху и их выбора для анализа. Эта система обеспечивает визуальный контроль для совмещения кончика волокна с выбранной клеткой перед абляцией и анализом. Она состоит из прецизионного зум-оптического насадки с семикратным увеличением, объектива с бесконечной коррекцией и большим рабочим расстоянием с десятикратным увеличением, а также ПЗС-камеры.
Система электрораспыления была сконструирована с использованием металлического соединения с проводящими перфторэластомерными феррулами, трубок, гильзового порта для иглы, а также кварцевых трубок FU. Рекомендуемый эмиттер изготовлен из нержавеющей стали и имеет конический наконечник диаметром 50 µm; для электрораспыления приготовьте 50% раствор метанола с 0,1% уксусной кислоты. Подавайте раствор со скоростью от 200 до 300 nL/min с помощью шприцевого насоса.
С помощью шприца объемом 500 µL с помощью регулируемого источника питания к металлическому соединению будет подано высокое напряжение в диапазоне от 2 до 803 000 В. Для создания стабильного электрораспыления убедитесь, что все электрические соединения надежно закреплены и защищены экранированием, а также надлежащим образом заземлены, так как прямой контакт с открытым высоким напряжением может привести к поражению электрическим током. Получите образец живой ткани или клеток из соответствующего источника и храните их согласно рекомендациям перед проведением анализа.
Луковицы Allium cepa для данной демонстрации были приобретены в местном магазине. Для подготовки образцов луковиц Allium cepa разрежьте луковицу продольно хирургическим скальпелем и вырежьте сегмент чешуи размером примерно два квадратных сантиметра. Затем отделите неповрежденный монослой внутренней эпидермальной ткани. Используя влажную поверхность эпидермиса, закрепите ткань на предварительно очищенном предметном стекле микроскопа.
Зафиксируйте предметное стекло с помощью универсального держателя для пластин, установленного на трехкоординатном перемещающем столике для позиционирования. Чтобы предотвратить деградацию клеток, снимите масс-спектры сразу после установки образца. Начните с включения лазера, системы электрораспыления и масс-спектрометра.
Оптимизируйте геометрию источника ионов ленивого испарения, регулируя взаимное расположение пятна абляции и эмиттера электрораспыления относительно друг друга и отверстия масс-спектрометра. Для достижения максимальной интенсивности ионов выберите интересующую вас ячейку для анализа, используя систему визуализации с видом сверху. После выбора переместите предметный столик так, чтобы выбранная ячейка оказалась точно под заостренным наконечником оптического волокна.
С помощью микроскопа с видом сбоку отрегулируйте расстояние от наконечника до поверхности клетки примерно до 20 микрон. После достижения правильного положения подайте лазерные импульсы в выбранную клетку через вытравленный наконечник волокна. Это приведет к перфорации клеточной стенки и выбросу цитоплазмы в виде твердых частиц.
После постонизации методом электрораспыления образовавшиеся ионы регистрируются масс-спектрометром с записью масс-спектров. После получения данных переведите лазер, электрораспылитель и масс-спектрометр в режим ожидания или выключите их. Сохраните образец ткани *Allium cepa* после абляции для возможного исследования с помощью световой микроскопии; успешная абляция одной клетки приводит к разрыву клеточной стенки и получению четкого масс-спектра.
Ниже представлены результаты анализа методом масс-спектрометрии с лазерной десорбцией (lazy MS) одной встроенной эпидермальной клетки луковицы Allium cepa с репрезентативным изображением, полученным с помощью оптической микроскопии. После забора пробы из клетки клеточная стенка перфорируется, при этом область перфорации ограничена границами с соседними клетками. Соседние клетки выглядят неповрежденными.
Здесь представлен репрезентативный масс-спектр, полученный из одной клетки. В каждой клетке лука обнаруживается широкий спектр ионов, которые на основании их точных масс, профилей изотопного распределения и тандемных масс-спектров тщательно соотносятся с эндогенными метаболитами. Ионы, обнаруженные в одной клетке, были схожи с ионами, наблюдаемыми при анализе той же ткани с помощью традиционной масс-спектрометрии нескольких клеток.
Мы только что продемонстрировали вам способ анализа одиночных живых клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении. При выполнении данной процедуры важно не забывать использовать защитные очки, чтобы избежать случайного воздействия инфракрасных лазеров четвертого класса. На этом все.
Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данном исследовании демонстрируется применение масс-спектрометрии с лазерной абляционной электрораспылительной ионизацией (LAESI) для анализа отдельных растительных и животных клеток. Этот метод позволяет проводить прямой анализ клеточных метаболитов и липидов при атмосферном давлении.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Масс-спектрометрия
- Клеточная биология
- Аналитическая химия
Теоретические сведения
- Анализ отдельных клеток имеет решающее значение для понимания клеточных функций.
- Масс-спектрометрия LAESI позволяет анализировать биомолекулы без длительной подготовки образцов.
- Данный метод применим как к растительным, так и к животным клеткам.
- Изучение метаболитов и липидов позволяет получить представление о клеточных процессах.
Цель исследования
- Разработать метод прямого анализа отдельных живых клеток.
- Исследовать метаболиты и липиды, присутствующие в отдельных клетках.
- Продемонстрировать применимость масс-спектрометрии LAESI в биологических исследованиях.
Используемые методы
- Выбор отдельной клетки с помощью микроскопа с большим рабочим расстоянием.
- Абляция клетки с использованием лазерного импульса, подаваемого через оптическое волокно.
- Ионизация облака абляции с помощью системы электрораспыления.
- Сбор масс-спектров с использованием масс-спектрометра.
Основные результаты
- Успешная абляция одиночных клеток привела к получению масс-спектров, содержащих пики, соответствующие метаболитам и липидам.
- Метод продемонстрировал минимальное повреждение соседних клеток.
- Масс-спектры предоставили подробную информацию о клеточном составе.
- Системы визуальной обратной связи повысили точность выбора и анализа клеток.
Выводы
- Масс-спектрометрия LAESI является эффективным инструментом для анализа отдельных клеток.
- Данный метод позволяет проводить анализ клеточных компонентов в режиме реального времени.
- Этот метод может быть применен в различных биологических исследованиях с использованием отдельных клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямая масс-спектрометрия отдельных клеток при атмосферном давлении позволяет проводить безмаркерное метаболическое профилирование без нарушения нативного состояния клеток, что способствует ранней валидации мишеней за счет выявления гетерогенной экспрессии биомаркеров в изогенных популяциях. Эта возможность снижает риски при идентификации перспективных соединений-лидеров, предоставляя количественные, пространственно-разрешенные данные о метаболитах, которые коррелируют с результатами фенотипического скрининга и позволяют принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при доклиническом отборе мишеней. Совместимость метода с живыми клетками и минимальная подготовка образцов соответствуют рабочим процессам на этапе поиска новых лекарств, требующим быстрого и воспроизводимого фенотипического закрепления молекулярных мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования гетерогенности эндогенных метаболитов и липидов в одиночных живых клетках в физиологических условиях.
- Практическая ценность: снижает механистическую неопределенность за счет прямого безмаркерного детектирования биохимических веществ без артефактов фиксации или экстракции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные, воспроизводимые масс-спектры отдельных клеток, что обеспечивает стандартизацию анализа для фенотипического скрининга на основе метаболитов.
- Практическая ценность: Обеспечивает масштабируемость платформы за счет использования лазерной абляции с доставкой через оптоволокно и электрораспылительной ионизации, что облегчает интеграцию в автоматизированные рабочие процессы анализа единичных клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает метаболические фенотипы на этапе открытия с доклиническими моделями, предоставляя трансляционные кандидаты в биомаркеры на основе данных одноклеточного LAESI-MS.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от валидации мишени до оптимизации ведущего соединения, предоставляя согласованные молекулярные показатели без использования депо для различных типов клеток и условий.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени на основе гипотезы до идентификации ведущих соединений, при этом метаболическое профилирование отдельных клеток позволяет повысить достоверность выбора мишени и оптимизировать дизайн фенотипического анализа перед скринингом соединений.
- Поисковая биология: способствует уточнению путей метаболизма и снижению биологических рисков путем обнаружения эндогенных метаболитов и липидов непосредственно в отдельном аблированном細胞.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет создания количественных масс-спектров без осадка, отражающих нативную биохимию клетки.
- Аналитика: предоставляет данные о метаболитах и липидах с помощью точного определения массы, изотопного распределения и тандемной масс-спектрометрии (MS), что позволяет проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем идентификации сигнатур метаболитов, которые соответствуют системам, значимым для заболевания, и поддерживают согласование биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемым аналитическим инструментом для лонгитюдных исследований отдельных клеток, снижая необходимость в повторной валидации в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишеней посредством прямой ионизации клеточных метаболитов при атмосферном давлении без нарушения структуры образца.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет использования лазерной абляции с оптоволоконным выводом и контролируемой ионизации электрораспылением при атмосферном давлении.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения биологических рисков на поздних этапах путем раннего метаболического анализа рисков мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков благодаря разрешению на уровне отдельных клеток при анализе гетерогенных ответов, что позволяет проводить стратификацию эффектов соединений.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области лазерной безопасности, юстировки оптики и интерпретации данных масс-спектрометрии для абляции в среднем ИК-диапазоне и ионизации электрораспылением.
- Метод зависит от использования перестраиваемых лазерных систем среднего ИК-диапазона, волоконных систем доставки излучения, высоковольтных эмиттеров для электрораспыления и синхронизированного сбора данных масс-спектрометром.
- Необходима межлабораторная стандартизация правил работы с клетками, параметров абляции и геометрии распыления для обеспечения воспроизводимого выхода ионов в разных лабораториях.
- При переходе от моделей растений к моделям млекопитающих или микроорганизмов следует учитывать необходимость адаптации метода к различным размерам клеток, жесткости мембран и составу внеклеточного матрикса.
- Существуют практические ограничения, такие как эффекты рассеяния факела абляции и зависимость эффективности ионизации от расстояния между точкой абляции и распылителем, что отмечено на этапах оптимизации геометрии.
