Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях

Общая цель следующего эксперимента — оценить наличие белок-белковых взаимодействий на поверхности клетки. Это достигается путем клонирования двух интересующих рецепторов, причем один из них присоединен к двум флуорофорам с перекрывающимися спектрами испускания, в качестве второго этапа. Два вектора одновременно трансфицируют в эндотелиальные клетки для экспрессии рецепторов.

На данном этапе флуорофоры помогают оценить общий уровень экспрессии, а также локализацию рецептора. Затем, с использованием одиночной трансфекции в качестве контроля, на конфокальном микроскопе устанавливаются параметры визуализации. Отдельные трансфецированные клетки отбираются на основании относительного уровня экспрессии и локализации рецептора.

Затем проводится визуализация областей внутри этих клеток для оценки степени полученных результатов FRET. Данные демонстрируют взаимодействия Tie1 и Tie2 на поверхности эндотелиальных клеток на основе FRET и конфокальной микроскопии. Здравствуйте, я Том Сигер из лаборатории доктора Уильяма Бартона на кафедре биохимии и молекулярной биологии Университета Содружества Виргинии.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру оценки белок-белковых взаимодействий в эндотелиальных клетках с помощью конфокальной микроскопии на основе FRET. В нашей лаборатории этот метод используется для изучения взаимодействий рецепторов в процессе ангиогенеза. Итак, приступим.

Для визуализации белок-белковых взаимодействий с помощью анализа близости на основе FRET начните с клонирования интересующих вас рецепторов в сайты NheI/EcoRI вектора pCDA3.1 hydro или neo, содержащего мономерный CFP или YFP. Определение FRET носит эмпирический характер и критически зависит от длины линкера между трансмембранным доменом и началом флуоресцентного белка. Следовательно, для каждой новой исследуемой пары рецепторов необходимо изучить несколько различных вариантов длины линкера. Трансформируйте и амплифицируйте векторы в соответствии с прилагаемым протоколом.

Затем подготовьте ДНК степени чистоты для трансфекции, трансформируйте и амплифицируйте векторы в соответствии с прилагаемым протоколом. После этого подготовьте ДНК степени чистоты для трансфекции и разведите ее до рабочей концентрации 1 µg/µL. Чтобы подготовить клетки к трансфекции, в ламинарном шкафу для культур тканей перенесите клетки EAHY 92 6, выращенные в полной среде DMEM, в 35-миллиметровые чашки с покровными стеклами, добавив 2 mL среды. Подготовьте одну чашку для оценки экспрессии каждого отдельного рецептора, а также по одной чашке для каждой пары рецепторов.

Инкубируйте клетки в атмосфере с 5% carbon dioxide при 37 °C до следующего дня. К дню трансфекции конфлюэнтность культуры должна составлять примерно 70–90%. Для приготовления нуклеолипидных комплексов смешайте 2 µg ДНК вектора химерного рецептора с 8 µL Fuji N HD в 200 µL предварительно нагретого Optimum. Для пар рецепторов трансфицируйте по 1 µg каждого рецептора (всего 2 µg); осторожно перемешайте путем инверсии и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

В период инкубации подготовьте клетки к трансфекции: аспирируйте свежую среду и осторожно и быстро промойте каждую лунку теплым PBS перед добавлением двух миллилитров предварительно подогретой полной среды DMEM без антибиотиков. Важно избегать присутствия пенициллина и стрептомицина, так как они значительно более токсичны для клеток во время обработки. Добавьте комплекс с FU gene HD к клеткам по каплям и инкубируйте еще 20–24 часа. Через 24 часа осторожно аспирируйте среду из лунок и с помощью пипетки добавьте свежую полную среду DMEM с антибиотиками после проведения трансфекции.

Жизнеспособность клеток должна оставаться относительно высокой. Плавающих клеток должно быть мало или они должны отсутствовать. Для проведения визуализации живых клеток мы используем конфокальный лазерный сканирующий микроскоп A-T-C-S-P two A OBS, оснащенный синим диодным, аргоновым, а также зеленым, оранжевым и красным гелий-неоновыми лазерами, глицериновым иммерсионным объективом H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA, моторизованным XY-столиком и инкубатором для предметного столика с контролем температуры, влажности и содержания углекислого газа.

Экспериментальный контроль крайне важен для устранения перекрестных помех между эмиссионными каналами флуорофоров, а также для оценки проблем с экспрессией и неспецифической флуоресценции. Таким образом, для настройки каждой сессии визуализации используются трансфекции с одним флуорофором, что позволяет исключить перекрестные помехи между эмиссионными каналами CFP и YFP. Поместите контрольный образец экспрессии CFP в инкубатор предметного столика, используя белый свет.

Отрегулируйте положение предметного столика по оси Z, чтобы сфокусироваться на клетках. Установите параметры окна спектрального сканирования (SP) для детектирования эмиссии CFP в диапазоне от 465 до 505 нм, а YFP — от 525 до 600 нм; при мониторинге обоих каналов эмиссии возбудите CFP при 458 нм. Используя A OTF, установите мощность лазера таким образом, чтобы исключить значительное перекрытие спектров (bleed-over) CFP в канал эмиссии YFP.

Сохраните этот параметр. Выполните аналогичный контроль перекрестного сигнала YFP в канале CFP, отрегулировав мощность возбуждения на 514 нанометрах. Сохраните этот параметр для клеток, экспрессирующих только YFP.

Затем поместите клетки, экспрессирующие CFP и YFP, в инкубатор предметного столика. Используя настройки сканирования программного обеспечения конфокального микроскопа LICO, найдите клетки с надлежащей мембранной локализацией и схожими уровнями экспрессии CFP и YFP, используя программу фотообесцвечивания, встроенную в данное ПО.

Установите настройки донора и акцептора в соответствии с вашими сохраненными настройками для CFP и YFP соответственно. Приблизив изображение клетки, выделите область интереса (ROI), в которой должно произойти фоторазрушение YFP на клеточной мембране, и запустите программу фоторазрушения акцептора. Установите AOTF на 100% для 514 нм и продолжайте лазерное выжигание до тех пор, пока эмиссия YFP не снизится на 70%.

Для ускорения выцветания при фотообесцвечивании обычно выбирают области интереса (ROI) вдоль растровой оси лазера. Контролируйте перемещение клеток и отклоняйте результаты измерений, полученные при заметном смещении в плоскости XY. Поскольку такие измерения могут привести к ложным значениям эффективности FRET, до и после обесцвечивания регистрируются изображения как для донора, так и для акцептора; эффективность FRET рассчитывается по формуле: эффективность FRET равна (post - DLO) / depost для всех depost > D pre, где D pre и D post — интенсивность донора до и после фотообесцвечивания соответственно.

JMP используется для определения степени экспериментальной вариабельности. Отдельные рецепторы должны быть слиты как с CFP, так и с YFP с использованием юкстамембранных последовательностей различной длины. Для поиска наилучшей пары партнеров по FRET рецепторов эффективность трансфекции обычно составляет от 30 до 40%, несмотря на результаты предыдущих исследований других авторов.

Мы не заметили, чтобы трансфекция и экспрессия одного вектора способствовали экспрессии другого. Напротив, мы часто наблюдаем экспрессию только одного из них. На этих репрезентативных изображениях показан анализ фотообесцвечивания акцептора для определения FRET между CFP и YFP в клетке EAHY 9 26.

Каналы эмиссии CFP и YFP контролировали раздельно до и после фотообесцвечивания; расчеты ограничивали выбранной областью. Внутри красного прямоугольника эффективность FRET представлена в абсолютном диапазоне от высокой (красный цвет, 1,0) до низкой (пурпурный цвет, 0) на увеличенном совмещенном изображении CFP/YFP (A-C-F-P-Y-F-P) исключительно для ориентирования в системе T-рецепторов. Типичные значения эффективности FRET, как показано здесь, составляют от 20 до 28% для эпителиальных клеток и от 19 до 23% для эндотелиальных клеток.

После освоения эта методика обычно занимает от трех до четырех дней при условии правильного выполнения. При проведении данной процедуры важно помнить, что длина линкера между целевым белком и слитым флуоресцентным белком, а также уровни их экспрессии и клеточная подвижность напрямую влияют на измерение FRET после завершения процедуры. Кроме того, для изучения путей передачи сигнала после его разработки можно провести биохимические анализы активации сигнала.

Данный метод представляет собой анализ, позволяющий изучать слабые или транзиторные белок-белковые взаимодействия. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как проводить собственные анализы близости на основе FRET в живых клетках. И не забывайте, что при работе с культурами клеток и тканей необходимо всегда соблюдать соответствующие меры предосторожности.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших будущих экспериментах по изучению ретикулярных волокон.