Опробование двигательную активность по изучению циркадные ритмы сна и параметров в Drosophila

Общая цель следующего эксперимента заключается в характеристике циркадных фенотипов и фенотипов сна у drosophila путем анализа суточных ритмов локомоторной активности. Это достигается путем создания трансгенных мух, получения специфических мутантов или проведения необходимых скрещиваний для подготовки экспериментальных животных. На втором этапе необходимо подготовить стеклянные трубки для мониторинга активности, содержащие питательную среду, которые будут служить средой обитания мух во время эксперимента.

Затем мух в возрасте от одного до пяти дней помещают в трубки для активности, которые затем устанавливают в мониторы активности DAM для отслеживания ритмов локомоторной активности. С помощью системы DAM получают результаты, демонстрирующие дефекты и вариации циркадных параметров и параметров сна на основе анализа ежедневных ритмов локомоторной активности с использованием такого программного обеспечения, как far sex и insomniac. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области циркадной биологии, например, о том, какие белки и регуляторные механизмы участвуют в формировании правильных ритмов, и каким образом факторы окружающей среды, такие как свет и температура, модулируют поведенческие ритмы через специфические молекулярные пути.

Система мониторинга локомоторной активности включает в себя многочисленное оборудование, такое как специализированные устройства мониторинга, инкубаторы с возможностью контроля дневного освещения, устройства сбора данных, компьютеры и периферийные материалы, например, проводку. Для размещения системы мониторинга локомоторной активности выберите хорошо вентилируемое помещение с регулируемой температурой (темную комнату), чтобы избежать чрезмерной нагрузки на инкубаторы и исключить возможные сбои в поддержании температуры; изолируйте комнату от внешних источников света. Нет необходимости работать в полной темноте, поскольку циркадная система плодовых мушек не чувствительна к инфракрасному излучению.

Следовательно, в случаях, когда необходимо видеть в темной комнате, мы просто используем стандартный фонарик, накрытый красным фильтром, и источник бесперебойного питания (ИБП), имеющий достаточную мощность для питания компонентов системы мониторинга активности. В случае скачка напряжения или отключения электроэнергии в здании подключите ИБП к аварийному контуру электроснабжения здания, если таковой имеется. Если система управления освещением в инкубаторе не регулируется самим инкубатором напрямую, то достаточно подключить инкубатор к аварийному питанию без использования ИБП, так как кратковременная потеря питания в течение нескольких секунд не повлияет на температуру в камере.

Затем подготовьте компьютер (PC или Macintosh), полностью предназначенный для сбора данных и/или управления инкубаторами. Аккуратно проложите сеть телефонных линий вокруг стеллажей инкубаторов с контролируемой средой, чтобы обеспечить удобство подключения и отключения оборудования. Установите мониторы таким образом, чтобы несколько телефонных линий сходились в одну общую линию, выходящую из инкубатора для подключения к компьютеру; соедините устройства мониторинга внутри инкубаторов с компьютером через блок интерфейса электропитания, который обеспечивает питание монитора активности через телефонную линию.

Наконец, заклейте армированным скотчем или закройте черной тканью возможные источники света, такие как светодиоды электронных устройств или неплотно прилегающая дверца инкубатора. Это необходимо для того, чтобы измерения ритмов с произвольным периодом проводились в отсутствие нежелательного освещения. Крайне важно оценивать данные фенотипы с использованием соответствующих контрольных животных того же возраста, выращенных в тех же условиях окружающей среды.

Кроме того, наблюдается половой диморфизм в циркадной ритмичности. Общепринятой практикой для данных анализов является использование взрослых самцов мух в возрасте от одного до пяти дней, выращенных при температуре 25 °C, так как активность самки по откладке яиц будет влиять на истинное измерение локомоторной активности. При изучении параметров циркадного ритма и сна-бодрствования конкретных интересующих мутантных линий мух целесообразно провести возвратное скрещивание мутантного штамма с диким типом того же генетического фона.

Например, W 1118 или yw. Поскольку у самцов дрозофилы не происходит кроссинговера, рекомендуется проводить ауткроссинг, скрещивая мутантных самок с самцами дикого типа. Посейте мух дикого типа (контроль) и мутантных мух одновременно на стандартный корм для дрозофил примерно на 10–14 дней до начала эксперимента по исследованию ритмов локомоторной активности. После вылета потомства соберите самцов в возрасте от одного до пяти дней и отложите их для использования в экспериментах.

Трубки для оценки активности имитируют среду обитания мух. В данном эксперименте используются тонкие стеклянные трубки диаметром 5 мм, один конец которых содержит питательную среду, а другой закрыт пряжей или пластиковой пробкой. Рекомендуется использовать свежеприготовленные трубки для оценки активности.

Как правило, их подготавливают за несколько дней или за неделю до начала эксперимента. Поскольку стеклянные пробирки для определения активности можно использовать многократно, в следующих процедурах подготовки в качестве отправной точки рассматриваются ранее использованные и неочищенные пробирки. Если вы используете новые пробирки, просто перейдите к этапу автоклавирования пробирок, описанному далее.

Извлеките пробки из использованных пробирок для анализа и поместите их в большой стеклянный стакан. Пробирки должны заполнять стакан не более чем наполовину. Наполните стакан водопроводной водой, чтобы пробирки были полностью погружены в жидкость.

Поместите стакан сglass tubes в микроволновую печь и нагревайте до интенсивного кипения воды. Будьте осторожны при расплавлении воска и агаризованной питательной среды, так как вода горячая. Извлеките стакан из микроволновой печи и перемешайте содержимое пробирок с помощью шпателя или пластикового стержня.

пипеткой на 10 мм, чтобы застрявший воск всплыл на поверхность. Затем повторите этап нагрева в микроволновой печи. Извлеките стакан из микроволновой печи и дайте ему остыть.

Помещение стакана в холодильную комнату ускорит процесс. По мере охлаждения воды воск будет собираться на поверхности и постепенно затвердевать. Удалите затвердевший воск вручную.

Это должно удалить большую часть воска с пробирок. Перенесите пробирки с активностью в новый стакан со свежей водопроводной водой и повторите процесс микроволнового нагрева и удаления воска. Поскольку большая часть воска была удалена на предыдущем этапе, ждать его затвердевания не требуется.

Просто слейте воду из стакана и перенесите пробирки в новый стакан. Соблюдайте осторожность, так как вода все еще горячая. Повторите процесс нагрева в микроволновой печи в последний раз.

Слейте воду из стакана и дождитесь охлаждения пробирок с реакционной смесью. Затем вертикально поместите пробирки в стеклянные стаканы объемом 250 мл или 500 мл. Убедитесь, что они расположены не слишком плотно.

Стерилизуйте их в автоклаве с использованием сухого цикла или просто высушите пробирки в сушильном шкафу, чтобы подготовить среду для загрузки в рабочие пробирки. Приготовьте раствор 5% сахарозы и 2% бактериального агара в дистиллированной или водопроводной воде, затем автоклавируйте раствор. Автоклавированная среда может быть использована сразу или храниться при температуре 4 °C в течение длительного периода времени.

В идеале температура кормовой среды при заполнении пробирок для определения активности должна составлять около 65 °C. С помощью пипетки объемом 10 мл внесите жидкий раствор корма вдоль внутренней стенки стеклянного стакана, заполняя пробирки примерно на одну треть снизу.

Дождитесь полного затвердевания корма при комнатной температуре или при 4 °C. После того как конденсат внутри стеклянных пробирок исчезнет, их можно извлечь из стакана. Чтобы извлечь пробирки с активностью из стакана, прижмите их к дну стакана и одновременно поверните, чтобы затвердевший корм внутри пробирок отделился от дна стакана.

Извлеките пробирки из стакана, желательно одной группой. Затем поочередно протрите каждую пробирку бумажными полотенцами, чтобы удалить излишки питательной среды с внешней поверхности. Поместите пробирки в чистый контейнер.

Возьмите обычный лабораторный нагреватель для пробирок без держателя и осторожно закройте нагревательную лунку. Выстелите лунку несколькими слоями плотной алюминиевой фольги, засыпьте в нее гранулы парафина и расплавьте их. Удерживая пробирки за верхний конец, погрузите нижний конец в расплавленный воск. Чтобы ускорить затвердевание воска, погрузите запарафиненную часть в стеклянный стакан с холодной водой. Повторите процедуру.

Краткое погружение восковых трубок в воду предотвратит их слипание. Трубки можно использовать сразу или хранить в герметичном контейнере при температуре 4 °C. При хранении более одной недели корм может чрезмерно пересохнуть.

Если пробирки хранились при температуре 4 °C, перед использованием доведите их до комнатной температуры, оставив на лабораторном столе. Перед помещением мух в пробирки для анализа активности включите инкубаторы, в которых будут размещены мониторы активности. Отрегулируйте температуру с помощью органов управления инкубатором и установите режим освещенности (свет/темнота) с помощью контроллера освещения системы DAM или собственной системы управления освещением инкубатора в соответствии с планируемым дизайном эксперимента.

Затем подвергните мух анестезии углекислым газом. После этого с помощью тонкой кисти для рисования аккуратно перенесите одну муху в трубку для измерения активности. Зажмите тонкими пинцетом середину отрезка пряжи длиной около половины дюйма и вставьте пряжу в конец трубки, противоположный стороне с кормом, чтобы закрыть отверстие и предотвратить побег мухи во время эксперимента.

Обеспечивая при этом приток воздуха в трубку, держите её в горизонтальном положении до пробуждения мухи. Чтобы муха не прилипла к корму, вставьте трубки в мониторы активности. При использовании более новой и компактной модели мониторов Tri Kinetics необходимо закрепить трубки резинками, чтобы инфракрасный луч проходил через центр трубки. Наконец, поместите мониторы активности в инкубаторы и подключите их к системе сбора данных с помощью телефонных проводов, проверив соединение.

С помощью программного обеспечения системы DAM убедитесь, что все мониторы подключены правильно и данные собираются с каждого из них. Теперь, когда мухи помещены в трубки для анализа активности, а система мониторинга локомоторной активности готова, можно приступать к записи данных. Мухи синхронизируются и приучаются к режиму путем воздействия желаемого светового, темнового или свето-темнового (LD) режима, а также температурного режима в течение от двух до пяти полных суток.

Наиболее часто используемым условием синхронизации является цикл «свет-темнота» продолжительностью 12 часов света и 12 часов темноты при температуре 25 °C. Для изучения циркадных ритмов в рамках данного протокола время включения света в инкубаторе определяется как ZT 0, и все остальные временные показатели рассчитываются относительно этого значения. В стандартных условиях цикла 12/12 LD особи дикого типа *Drosophila melanogaster* обычно демонстрируют два периода активности: один, сосредоточенный вокруг ZT 0 (утренний пик), и другой, вокруг ZT 12 (вечерний пик). Ритмы свободнобегающей локомоторной активности измеряются в условиях постоянной темноты и температуры после периода синхронизации.

Настройки светового цикла можно изменить в любое время в темную фазу последнего дня ld, чтобы следующий день эксперимента стал первым днем dd. Семидневного сбора данных в условиях DD достаточно для расчета циркадного периода, амплитуды или выраженности ритма у мух. В целом, для получения надежных значений периодов свободного хода для конкретного генотипа необходим размер выборки не менее 16 мух.

По завершении эксперимента необработанные бинарные данные, собранные с помощью программного обеспечения системы DAM, загружаются на портативное устройство хранения данных, например, на USB-накопитель. Необработанные бинарные данные обрабатываются с помощью программы DAM file scan 1 0 2 x и суммируются в интервалы по 15 и 30 минут при анализе циркадных параметров или в интервалы от одной до пяти минут при анализе сна.

Параметры покоя. В настоящее время стандартным определением сна у drosophila считается пять минут непрерывного отсутствия активности. После завершения данного протокола один и тот же набор данных можно использовать для сравнения циркадных параметров и параметров сна у экспериментальных и контрольных животных.

Графики индукции, иллюстрирующие ежедневную локомоторную активность или среднюю активность мух в течение нескольких дней в условиях LD или DD, могут быть созданы с помощью fast x oph melanogaster. В целом, у *D. melanogaster* наблюдаются два периода активности: один, сосредоточенный вокруг ZT 0, называемый утренним пиком, и другой, около ZT 12, называемый вечерним пиком. Эти два периода активности контролируются эндогенными часами и могут наблюдаться даже в условиях свободного хода при DD. Изменения во времени этих пиков активности легко заметны на графиках индукции и могут указывать на изменение свойств эндогенных часов.

Еще одним свойством, указывающим на правильное функционирование биологических часов, является предвосхищающее увеличение локомоторной активности, наблюдаемое в циклах LD перед фактическими переходами от темноты к свету или от света к темноте. Такое поведение отчетливо наблюдается у мух дикого типа, однако отсутствует и носит аритмичный характер у мутантов per zero. У этого мутанта.

Наблюдаемые утренние и вечерние пики при LD являются чисто старт-рефлексами, вызванными резкими изменениями условий освещенности. Мухи с нарушением работы биологических часов не предвосхищают изменения окружающей среды, а просто реагируют на них. Потеря поведенческой ритмичности гораздо более выражена при DD и обычно проявляется в полном исчезновении утренних или вечерних пиков локомоторной активности, как это наблюдается у мух per zero.

Помимо графиков индукции, данные о локомоторной активности могут быть представлены в виде двойного графика (actogram) для каждой отдельной мухи или генотипа мух, где данные за два дня последовательно наносятся на каждую строку, при этом профиль последнего дня начинает следующую строку, содержащую данные за два дня активности. Например, LD 1 и 2 наносятся на первую строку актограммы. Следующая строка начинается с повтора LD 2, за которым следуют LD 3 и так далее.

В соответствии с этим форматом данные о локомоторной активности за весь период эксперимента представлены в виде актограммы; одним из преимуществ актограмм перед графиками редукции является то, что изменение длительности периода суточных ритмов активности легко прослеживается. Помимо этого, создаются графики индукции и актограммы.

Данные о локомоторной активности в условиях DD можно загрузить в far X для расчета длины периода с помощью ряда различных программ, включая cycle P для анализа параметров сна и покоя, где последним определяется пять минут непрерывного отсутствия активности. Анализ данных, полученных в ходе тестов на локомоторную активность, и изучение многочисленных параметров сна можно проводить с помощью insomniac — программы на базе MATLAB; с её помощью можно рассчитать процент времени, которое мухи проводят во сне, за разные временные интервалы. Например, процент сна за каждый час или за каждые 12 часов.

Другие более распространенные параметры сна, которые могут быть изучены, включают среднюю продолжительность периода покоя, что является показателем консолидации сна и может иллюстрировать его качество. Другим параметром является количество активностей в состоянии бодрствования, которое измеряет интенсивность активности мух в периоды бодрствования. Этот параметр помогает дифференцировать мух с истинными нарушениями сна и поведения в покое от тех, которые больны или гиперактивны.

Например, мухи, которые просто больны, могут казаться более спящими из-за снижения их мобильности. У таких мух активность в состоянии бодрствования будет ниже по сравнению с контрольными животными. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как с помощью анализа характеризовать циркадные и сонные фенотипы у drosophila. Суточные ритмы локомоторной активности.