JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Опробование двигательную активность по изучению циркадные ритмы сна и параметров в Drosophila

Full Text

47,657 Views

18:08 min

September 28, 2010

DOI: 10.3791/2157-v

Joanna C. Chiu^1,2, Kwang Huei Low^1,3, Douglas H. Pike¹, Evrim Yildirim^1,3, Isaac Edery^1,3

¹Center for Advanced Biotechnology and Medicine,Rutgers University, ²Current Address: Department of Entomology, College of Agricultural and Environmental Sciences,University of California, Davis, ³Department of Molecular Biology and Biochemistry,Rutgers University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Мы описываем процедуры регистрации ежедневной двигательной активности ритмы

Transcript

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать циркадные фенотипы и фенотипы сна у дрозофил путем анализа суточных ритмов двигательной активности. Это достигается за счет создания траншейных мух, получения специфических мутантов или создания необходимых скрещиваний для подготовки подопытных животных. В качестве второго шага необходимо подготовить стеклянные пробирки для активности, содержащие источник пищи, который будет служить средой обитания мух во время эксперимента.

Следующих мушек в возрасте от одного до пяти дней помещают в активные трубки, которые загружаются в мониторы активности DAM для мониторинга ритмов двигательной активности. С помощью системы DAM получены результаты, которые показали дефекты и вариации циркадных параметров и параметров сна на основе анализа суточных ритмов двигательной активности с использованием таких программ, как дальний секс и бессонница. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области циркадной биологии, такие как какие белки и регуляторные механизмы участвуют в создании правильных ритмов, и, например, как факторы окружающей среды, такие как свет и температура, модулируют поведенческие ритмы через определенные молекулярные пути.

Система мониторинга опорно-двигательного аппарата включает в себя множество единиц оборудования, такого как специализированные устройства мониторинга, экологические инкубаторы, способные контролировать суточный свет, устройства сбора данных, компьютеры и периферийные материалы, такие как проводка, выбор хорошо вентилируемого регулятора температуры, темная комната для размещения системы мониторинга двигательной активности, чтобы избежать чрезмерной нагрузки на инкубаторы и исключить возможные сбои в поддержании температуры, изолировать помещение от внешнего мира. Источники света внутри темной комнаты. Не стоит работать полностью в темное время суток, так как плодовые мухи. Циркадная система не чувствительна к инфракрасному излучению.

Поэтому в случаях, когда нам нужно видеть в темной комнате, мы просто используем стандартный фонарик, который покрыт красным фильтром покупки, аварийный резервный блок бесперебойного питания, который имеет достаточную мощность мощности для питания компонентов системы мониторинга активности. В случае скачка напряжения или сбоя питания в здании подключите аварийный резервный блок ИБП к аварийной резервной цепи здания, если таковая имеется. Если система управления освещением в инкубаторе напрямую не регулируется инкубатором, то достаточно включить инкубатор в аварийное питание без ИБП, так как потеря питания на несколько секунд не повлияет на температуру в камере.

Затем настройте компьютер, ПК или Macintosh, полностью предназначенные для сбора данных и/или аналогичного управления инкубаторами. Вручную аккуратно расположите сеть телефонных линий вокруг стеллажей инкубаторов с контролируемой средой окружающей среды, чтобы обеспечить легкость подключения и отключения от сети. Мониторы устанавливают несколько телефонных линий таким образом, что они сходятся в одну основную линию и выходят за пределы инкубатора для подключения к компьютеру, подключают устройства мониторинга внутри инкубаторов к компьютеру через блок интерфейса источника питания, который служит для питания монитора активности через телефонную линию.

Наконец, замаскируйте возможные источники света от светодиодов электронных устройств или неправильно закрытую дверцу инкубатора скотчем или черной тканью. Для обеспечения свободного хода измеряются ритмы при отсутствии нежелательного света. Крайне важно оценить эти фенотипы с помощью надлежащих контрольных животных, которые выращиваются в тех же условиях окружающей среды и одного возраста.

Кроме того, наблюдается половой диморфизм в циркадной ритмичности. Общая практика заключается в использовании взрослых самцов мух для этих анализов, которые выращиваются при температуре 25 градусов Цельсия и в возрасте от одного до пяти дней, потому что активность откладывания яиц у самок мух влияет на истинное измерение локомоторной активности. При изучении циркадных ритмов и параметров покоя во сне конкретных мутантных мух, представляющих интерес, целесообразно скрещивать мутантную популяцию со штаммом дикого типа с тем же генетическим фоном.

Например, W 1118 или yw. Поскольку у самцов дрозофил скрещивания нет, лучше проводить ауткросс путем скрещивания мутантных самок с самцами дикого типа, которые одновременно сеют как контроль дикого типа, так и мутантные мухи. В стандартной пище дрозофил в течение примерно 10-14 дней до эксперимента по изменению ритма двигательной активности после включения потомства соберите самцов мух возрастом от одного до пяти дней и отложите их в сторону для использования в экспериментах.

Пробирки для активности представляют среду обитания мух. Во время эксперимента они представляют собой тонкие пятимиллиметровые стеклянные трубки, которые содержат пищевое вещество на одном конце и заглушены пряжей или пластиковой пробкой на другом конце. Предпочтительно использовать только что изготовленные пробирки для активности.

Как правило, их готовят за несколько дней или неделю до начала эксперимента. Поскольку стеклянные пробирки для активности можно использовать многократно, следующие процедуры подготовки описывают использование ранее использованных и нечистых пробирок для активности в качестве отправной точки. Если вы используете новые зонды для активности, просто перейдите к автоклавированию трубок, как показано ниже.

Выньте заглушки из использованных пробирок и вставьте их в большой стеклянный стакан. Трубка должна заполнять только до половины стакана. Наполните стакан водой из-под крана, обязательно погрузив трубки.

Разогрейте в микроволновой печи стакан, наполненный стеклянными трубками, пока вода не дойдет до полного быстрого кипения. Чтобы растопить воск и агаровую пищу, будьте осторожны, так как вода горячая. Достаньте стакан из микроволновки и перемешайте трубочки лопаткой или пластиком.

10-миллиметровая пипетка, чтобы захваченный воск всплыл наверх. Затем повторите шаг приготовления в микроволновой печи. Достаньте стакан из микроволновки и подождите, пока он остынет.

Помещение стакана в холодильную камеру ускорит процесс. По мере того, как вода остывает, воск будет собираться на поверхности воды и постепенно затвердевать. Удалите застывший воск вручную.

Это должно избавить от большей части воска на трубках. Переложите пробирки в новую мензурку со свежей водой из-под крана и повторите процесс разогрева в микроволновой печи и удаления воска. Поскольку большая часть воска была удалена на предыдущем этапе, нет необходимости ждать, пока воск застынет.

Просто вылейте воду из стакана и переложите трубки в новую мензурку. Будьте осторожны, так как вода еще горячая. Повторите процесс приготовления в микроволновой печи в последний раз.

Вылейте воду из стакана и подождите, пока пробирки остынут. Затем загрузите пробирки вертикально в стеклянные стаканы объемом 250 мл или 500 мл. Убедитесь, что они не упакованы слишком плотно.

Стерилизуйте их с помощью автоклава с сухим циклом или просто высушите пробирки в сушильном шкафу, чтобы подготовить пищу для загрузки в пробирки для активности. Сделайте раствор из 5%сахарозы и 2%bact, чтобы агар в дистиллированной или водопроводной воде автоклавировал раствор. Корм в автоклаве можно использовать сразу или хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение длительного периода времени.

В идеале пища должна быть при температуре около 65 градусов Цельсия для наполнения пробирок. С помощью пипетки объемом 10 миллилитров введите раствор жидкой пищи вдоль внутренней стенки стеклянного стакана, заполняя пробирки до тех пор, пока они не будут заполнены на треть снизу вверх. Осторожно набухните стаканом, чтобы убедиться, что все трубки равномерно заполнены пищевым раствором.

Подождите, пока пища полностью застынет либо при комнатной температуре, либо при четырех градусах Цельсия. Как только конденсация внутри стеклянных трубок рассеется, трубки можно извлечь из стакана. Чтобы извлечь пробирки активности из стакана, подтолкните трубки к нижней части стакана и одновременно поверните трубки так, чтобы затвердевшая пища внутри трубок и дно стакана разделились.

Выньте трубочки из стакана, желательно одним пучком. Далее очистите трубки одну за другой бумажными полотенцами, чтобы удалить излишки пищи с внешней поверхности трубок. Отложите трубки в чистую емкость.

Возьмите общелабораторный блочный нагреватель без держателя трубки и тщательно накройте нагреватель. С помощью нескольких слоев прочной алюминиевой фольги добавьте парафиновые гранулы в алюминиевую подкладку для нагрева, чтобы они хорошо расплавились, держите трубки за непищевой конец и окуните пищевой конец в расплавленный воск. Опустите восковую часть в стеклянный стакан, наполненный холодной водой, чтобы ускорить затвердевание воска. Повторять.

После погружения восковых трубок в воду они не слипнутся. Пробирки можно использовать сразу или хранить в герметичном контейнере при температуре четыре градуса Цельсия для использования. В течение недели длительное хранение приведет к чрезмерному пересыханию продукта.

Если пробирки хранятся при температуре четыре градуса Цельсия, нагрейте их до температуры окружающей среды, оставив на столе перед использованием. Прежде чем загружать мух в пробирки активности, включите инкубаторы, в которых будут размещаться мониторы активности. Отрегулируйте температуру с помощью органов управления инкубатором и установите световой темновой режим с помощью контроллера освещения системы DAM или собственной системы управления светом инкубатора в соответствии с желаемой экспериментальной конструкцией.

Далее обезболите мух углекислым газом. Затем с помощью тонкой кисти аккуратно перенесите одну муху в пробирку для активности. Возьмите середину одного куска пряжи длиной около полудюйма тонкими щипцами и вставьте пряжу в непищевой конец пробирки, чтобы закрыть отверстие и предотвратить побег мухи во время эксперимента.

В то же время пропуская воздух в трубку, держите трубку лежащей на боку, пока муха не проснутся. В более новой, более компактной модели мониторов Tri Kinetics необходимо удерживать трубки на месте с помощью резиновых лент, чтобы инфракрасный луч проходил через трубку в центральном положении. Наконец, поместите мониторы активности в инкубаторы и подключите их к системе сбора данных с помощью проверки телефонных проводов.

Использование программного обеспечения для сбора данных системы DAM позволяет убедиться, что все мониторы подключены должным образом и что данные собираются с каждого из них. Теперь, когда мухи загружены в трубки активности и система мониторинга опорно-двигательного аппарата готова, данные можно записывать. Мух синхронизируют и увлекают, подвергая их воздействию нужного света, темноты или LD и температурного режима в течение двух-пяти полных дней.

Наиболее часто используемым условием увлечения является светлый темный цикл из 12 часов света и 12 часов темноты при температуре 25 градусов Цельсия. Для изучения циркадных ритмов относительно этого протокола время, когда в инкубаторе загорается свет, определяется как ГАМК, умноженная на ноль Зика, а все остальные времена относятся к этому значению. При стандартных условиях от 12 до 12 LD при типировании roso melano gasta обычно демонстрируют два приступа активности: один сосредоточен вокруг ZT zero, называемый утренним пиком, а другой около ZT 12, называемый вечерним пиком свободного бега, двигательной активностью.

Настройка светового цикла может быть изменена в любое время в темной фазе в последний день dd, так что следующий день эксперимента будет представлять собой первый день dd. Семи дней сбора данных DD достаточно для расчета циркадного периода и амплитуды или силы ритма мух. В целом, размер выборки не менее 16 мух необходим для получения надежных периодов свободного хода для конкретного генотипа.

По завершении эксперимента необработанные двоичные данные, собранные с помощью системного программного обеспечения DAM, загружаются на портативное устройство хранения данных. Например, USB-ключ. Необработанные двоичные данные обрабатываются с помощью сканирования файла DAM 1, 0, 2 x и суммируются в ячейки по 15 и 30 минут при анализе циркадных параметров или от одной до пяти минут при анализе сна.

Остальные параметры. В настоящее время пять непрерывных минут бездействия являются стандартным определением сна у дрозофил. По завершении этого протокола можно использовать тот же набор данных для сравнения циркадных параметров и параметров сна экспериментальных и контрольных животных по циркадным параметрам.

Дукционные графики, иллюстрирующие ежедневную локомоторную активность или среднюю активность мух в течение нескольких дней в условиях LD или DD, могут быть построены с использованием fast x oph melanogaster, обычно демонстрируют два приступа активности: один сосредоточен вокруг нулевого уровня ZT, называемого утренним пиком, а другой — вокруг ZT 12, называемым вечерним пиком. Эти два приступа активности контролируются эндогенными часами и могут наблюдаться даже в условиях свободного хода DD. Изменения во времени этих пиков активности можно легко наблюдать на индукционных графиках, и они могут указывать на изменение свойств эндогенных часов.

Еще одним свойством, свидетельствующим о правильной работе часов, является опережающее увеличение двигательной активности, наблюдаемое в циклах ЛД, которое происходит до фактического перехода от темноты к свету или от светлого к темноте. Такое поведение отчетливо наблюдается у мух дикого типа, но отсутствует и аритмично на ноль мутантов. В этом мутанте.

Наблюдаемые утренние и вечерние пики ЛД являются чисто испугочными реакциями из-за резких изменений в светлых темных условиях. Бесчасовые мухи не предвидят изменений окружающей среды, а просто реагируют на них. Потеря поведенческой ритмичности гораздо более выражена при ДД и, как правило, проявляется в полной потере утренних или вечерних пиков двигательной активности, что наблюдается при нулевом количестве мух.

В дополнение к индукционным графикам, данные о двигательной активности могут быть представлены в виде двойного графика грамма для каждой отдельной мухи или генотипа мухи, где данные за два дня отображаются последовательно на каждой линии, но профиль последнего дня начинается со следующей строки двухдневной активности. Например, первая и вторая LD наносятся на первую строку диаграммы ACTO. Следующая строка начинается с повторения ЛД два, за ней следует ЛД три и так далее.

Следуя этому формату, данные о двигательной активности, охватывающие весь эксперимент, иллюстрируются в диаграмме ACTO, что является одним из преимуществ грамм ACTO по сравнению с графиками редукции. Является ли это изменением продолжительности периода ежедневной активности? Ритмы легко наблюдаются помимо создания индукционных графиков и ACTO-граммов.

Данные о двигательной активности из состояния DD могут быть переданы в far X для расчета длины периода с использованием ряда различных программ, включая цикл P для анализа параметров сна, отдыха, который определяется как пять непрерывных минут бездействия. Можно проанализировать данные, записанные в результате анализов опорно-двигательного аппарата, и изучить несколько параметров сна с помощью insomniac, программы, основанной на MATLAB, процент времени, которое мухи проводят во сне, может быть рассчитан в различные временные интервалы. Например, процент сна каждый час или каждые 12 часов.

Другие более распространенные параметры сна, которые можно изучить, включают среднюю продолжительность отдыха во время сна, которая является мерой того, насколько крепк сон, и может иллюстрировать качество сна. Другой способ — подсчет активности после пробуждения, который является мерой уровня активности, когда мухи бодрствуют. Этот параметр помогает отличить мух, которые действительно страдают от сна и отдыха, от больных или гиперактивных.

Например, может показаться, что просто больные мухи спят больше, потому что они не так подвижны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как охарактеризовать циркадный фенотип и фенотип сна у дрозофил с помощью анализа. Суточные ритмы двигательной активности.

Explore More Videos

Neuroscience выпуск 43 циркадный ритм двигательной активности дрозофила период сна Trikinetics