Оценка устьичного Ответ на живые бактериальные клетки с использованием полного изображения листьев
2 октября 2010 г.
Мы разработали простой и воспроизводимый протокол для доступа к устьичного ответ на живые бактерии. Этот метод минимизирует ранения и манипуляции листа по сравнению с использованием пилинга эпидермиса сообщалось ранее.
В данной процедуре используется визуализация листьев для оценки движения замыкающих клеток в ответ на воздействие живых бактериальных клеток. Сначала бактерии культивируют из глицеринового стока и готовят инокулят. Затем собирают молодые здоровые листья и окрашивают их пропидия йодидом.
Окрашенные листья разрезают, и фрагменты листьев инкубируют на поверхности бактериальной суспензии. В завершение поверхность листа исследуют под микроскопом, что позволяет измерить раскрытие устьиц. Результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, демонстрируют изменение раскрытия устьиц в ответ на воздействие бактерий.
Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как использование эпидермальных эксплантатов, является то, что лист, контактирующий с бактериями, остается целым, что имитирует естественные условия проникновения бактерий в листья. Для начала данной процедуры семена Arabidopsis высевают на смесь питательной среды, вермикулита и перлита в соотношении 1:1:1 (по объему). Растения выращивают в климатической камере, поливая по мере необходимости.
Растения будут готовы к использованию через четыре-шесть недель, когда у них появятся молодые, полностью развернутые листья до начала образования цветоноса. За два дня до начала эксперимента подготовьте посев бактериальной культуры. Высейте Pseudomonas ringe из глицеринового стока на модифицированную среду LB и инкубируйте в течение 24 часов при 28 °C.
Для приготовления инокулята используйте свежую культуру; посев на чашки всегда начинайте с глицериновых стоков. Поскольку бактерии теряют вирулентность при перепосевах, используйте бактерии, выросшие на чашке, для создания 10 мл жидкой культуры pseudomona singe. В колбе Эрленмейера объемом 50 мл инкубируйте культуру в течение ночи при 28 °C при интенсивном перемешивании до достижения оптической плотности (OD) при 600 нм в диапазоне от 0,8 до 1.
Измерьте OD при 600 нм и соберите клетки путем центрифугирования при 1 360 ×g в течение 10 минут. Ресуспендируйте клетки в дистиллированной воде так, чтобы конечная OD составила 0,2. Данное значение OD соответствует 10⁸ колониеобразующих единиц на миллилитр.
После подготовки бактерий приступайте к подготовке листьев и проведению анализа для их окрашивания. Сначала приготовьте 20 мкМ раствор пропидийиодида (PI) в воде. 10 мл раствора достаточно для одновременного окрашивания трех небольших листьев.
Извлеките растения из камеры роста и с помощью пинцета отделите три молодых полностью развернутых листа. Погрузите целые листья в раствор PI на пять минут. Затем извлеките листья и коротко промойте их дистиллированной водой.
Затем поместите лист на предметное стекло нижней стороной вниз. Острым лезвием бритвы разрежьте лист на четыре части, исключая центральную жилку, чтобы лист плотно прилегал к стеклу для инкубации бактерий с тканями листа. Добавьте 300 µL бактериальной суспензии под фрагменты листа на стекле, убедившись, что нижняя поверхность листа контактирует с инокулятом.
Инкубируйте образцы в тех же условиях окружающей среды, которые использовались для выращивания растений. Когда наступит время наблюдения за листьями под микроскопом, перенесите фрагменты листьев на новый предметное стекло нижней поверхностью вверх. Обратите внимание, что при подготовке препаратов покровное стекло не используется.
Один и тот же образец листа можно подвергать визуализации несколько раз в процессе инкубации, при этом временной ход может быть установлен в соответствии с целями исследования. В данном случае для исследования листьев используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп; при этом изучается нижняя поверхность листьев одних и тех же образцов для обнаружения флуоресценции PI и получения изображений устьиц с течением времени. Сохраните изображения для измерения ширины устьичной щели.
Измерьте ширину устьичного отверстия не менее чем для 60 устьиц для каждого варианта обработки в каждой временной точке. С помощью браузера изображений LSM рассчитайте среднее значение и стандартную ошибку ширины устьичного отверстия. Статистическую значимость результатов можно рассчитать с использованием двухстороннего парного t-критерия Стьюдента.
На данном изображении представлен типичный микроскопический снимок поверхности листа arabidopsis, полученный с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. В режиме светлого поля пропидиййодид окрашивает клеточные стенки жизнеспособных клеток, что повышает видимость замыкающих клеток и позволяет идентифицировать неповрежденные клетки. На этих микрофотографиях можно наблюдать различную степень раскрытия устьичных пор: от полностью закрытых до широко открытых устьиц.
Полностью закрытые устьица определяются по форме замыкающих клеток. Для открытых устьиц ширина устьичной щели считается равной 0 µm. Показанная ширина щели измеряется по прямой линии, проведенной через самую широкую область устьичной поры.
Представлены типичные результаты эксперимента по инокуляции живых листьев. Листья Arabidopsis инкубировали в темноте с тремя различными штаммами Pseudomonas; только бактерия P-S-T-D-C 3000 была способна открывать устьица в темноте, что определялось по ширине раскрытия 60 случайно выбранных устьиц для каждого бактериального штамма. Данный метод открыл исследователям в области взаимодействия растений и бактерий возможность изучать механизмы раннего ответа видов растений на патогены.
Обзор
В данном исследовании представлен новый протокол оценки реакций устьиц на живые бактерии с использованием целых листьев, что позволяет минимизировать повреждения по сравнению с традиционными методами. Данный метод позволяет в режиме реального времени наблюдать за движением замыкающих клеток в ответ на воздействие бактерий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Взаимодействия растений и микробов
- Физиология устьиц
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретические сведения
- Устьица имеют решающее значение для газообмена в растениях.
- Замыкающие клетки регулируют раскрытие устьичного отверстия в ответ на воздействия окружающей среды.
- Традиционные методы часто повреждают ткани листа, что влияет на результаты.
- Данное исследование направлено на улучшение оценки реакций устьиц на патогены.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый метод изучения реакции устьиц на живые бактерии.
- Минимизировать повреждение листьев в ходе эксперимента.
- Наблюдать за изменениями устьичной щели в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии.
Используемые методы
- Подготовка бактериальных культур из глицериновых стоков.
- Окрашивание тканей листа пропидия иодидом для визуализации.
- Инкубация образцов листьев с бактериальными суспензиями.
- Микроскопическая визуализация для измерения ширины устьичной щели в динамике.
Основные результаты
- Изменения устьичной апертуры наблюдались в ответ на воздействие различных штаммов бактерий.
- Метод с использованием целого листа позволил более точно оценить поведение устьиц.
- Статистический анализ подтвердил наличие значимых различий в ширине апертуры между вариантами обработки.
- Данная методика облегчает изучение взаимодействий между растением и патогеном.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к изучению реакций устьиц на воздействие патогенов.
- Он расширяет понимание механизмов защиты растений от бактериальных инфекций.
- Протокол может быть применен к различным видам растений для получения более широких результатов исследования.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет проводить неразрушающую оценку динамики устьиц в режиме реального времени в ответ на воздействие живых бактерий, что способствует механистическому снижению рисков при изучении взаимодействий между растением и патогеном. Сохраняя целостность листа и имитируя естественные условия инфекции, этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах валидации мишеней для разработки агрохимикатов или биопестицидов. Данный метод позволяет решить ключевую задачу на этапе открытия: отличить прямое влияние бактерий на физиологию хозяина от вторичных стрессовых реакций.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественной оценки изменений устьичного отверстия как функционального показателя бактериальной вирулентности или активации защитных механизмов хозяина.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет воспроизводимых количественных измерений движения замыкающих клеток в контролируемых условиях совместного инкубирования.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля исследований путем идентификации бактериальных штаммов или соединений, которые значительно изменяют поведение устьиц, что указывает на потенциальную патогенную или иммуномодулирующую активность.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать валидированные биологические системы (целые листья с окрашенными замыкающими клетками), подходящие для последующего скрининга соединений или штаммов.
- Количественные показатели: обеспечивает получение измеримых данных о размере устьичной щели с временным разрешением, что позволяет проводить анализ зависимости «доза-эффект» и кинетический анализ.
- Масштабируемость: позволяет проводить повторную визуализацию одного и того же образца листа с течением времени, что увеличивает пропускную способность и снижает биологическую вариабельность.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует естественные точки проникновения патогенов, предоставляя релевантную с точки зрения заболевания систему для оценки методов вмешательства, блокирующих бактериальную инвазию или модулирующих иммунитет хозяина.
- Трансляционная преемственность: Связывает mechanistic-инсайты этапа первичного поиска с доклинической валидацией за счет сохранения физиологического контекста на протяжении всего эксперимента.
- Принятие решений с учетом рисков: Позволяет на раннем этапе оценить, предотвращает ли кандидатное соединение индуцированное патогеном открытие устьиц, что служит основой для принятия решения о продолжении или прекращении дальнейшей разработки (go/no-go).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов открытий, поддерживая проверку гипотез при валидации мишеней и обеспечивая воспроизводимую разработку анализов для скрининговых кампаний, направленных на поиск модуляторов иммунитета растений или антивирулентных агентов.
- Биология открытий: способствует снижению механистических рисков, изолируя устьичную реакцию в качестве зависимой переменной в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные измерения устьичной щели, что позволяет проводить надежную оценку соединений в различных условиях.
- Аналитика: предоставляет данные о ширине устьичной щели и статистические результаты (среднее значение, стандартная ошибка, значимость t-критерия), что позволяет сравнивать разные условия и определять величину эффекта.
- Трансляционные исследования: сохраняет жизнеспособность листа и естественную топологию поверхности, гарантируя, что наблюдения отражают физиологически значимое поведение замыкающих клеток.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу на основе визуализации, применимую к различным бактериальным штаммам, видам растений или химическим библиотекам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, напрямую связывая воздействие бактерий с динамикой устьиц в интактной ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет минимизации повреждений листьев и согласованного контроля условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя ранние физиологически значимые сигналы об эффективности, что снижает риск неудач на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов с учетом рисков, основываясь на их способности модулировать иммунный ответ устьиц.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с растительными тканями, приготовления бактериальных культур и проведения конфокальной микроскопии.
- Метод зависит от наличия лазерного сканирующего конфокального микроскопа и инструментов анализа изображений для стоматарной морфометрии.
- Необходима стандартизация условий инкубации (освещенность, влажность, температура) для обеспечения воспроизводимости результатов между сериями экспериментов.
- Адаптация метода для других видов растений может потребовать оптимизации продолжительности окрашивания и концентрации бактерий.
- Практическое ограничение: длительные сеансы визуализации могут вызвать стресс у листьев, что требует мониторинга жизнеспособности образцов с течением времени.
