Оценка устьичного Ответ на живые бактериальные клетки с использованием полного изображения листьев

В этой процедуре визуализация листьев используется для оценки движения защитных клеток в ответ на живые бактериальные клетки. Сначала бактерии культивируются из глицеринового бульона и получают инокулюм. Затем молодые здоровые листья собирают и окрашивают йодидом пропидиума.

Окрашенные листья срезают, а кусочки листьев инкубируют на вершине бактериальной суспензии. Наконец, поверхность листа изучается под микроскопом и можно измерить устьичные отверстия. Результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, показывают изменения в устьичной апертуре в ответ на действия бактерий.

Основное преимущество данного метода перед существующими методами вроде использования эпидермальных пилингов, заключается в том, что лист при контакте с бактериями остается неповрежденным, имитируя естественные условия для проникновения бактерий в листья. Так арабидопсис сеет на смесь питательной среды один к одному, к одному V к V. Найдите вермикулит амит свет, вырастите растения в камере для выращивания и поливайте по мере необходимости.

Растения готовы к использованию через четыре-шесть недель, когда у них появятся молодые, полностью раскрывшиеся листья до завязывания. За два дня до начала эксперимента подготовьте полосу бактериальной культуры. Pseudomonas получают из запасов глицерина на модифицированной среде LB и инкубируют в течение 24 часов при температуре 28 градусов Цельсия.

Используйте свежую культуру для приготовления посевного материала и всегда начинайте выращивание культуральных пластин из запасов глицерина. Поскольку бактерии становятся менее вирулентными после субкультуры, используйте бактерии, которые выросли на планшете, чтобы начать выращивание жидкой культуры pseudomona singe объемом 10 миллилитров. В колбе Эрленмейера объемом 50 миллилитров инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с энергичным встряхиванием до тех пор, пока она не достигнет оптической плотности или od при 600 нанометрах от 0,8 до единицы.

Измерьте OD при 600 и соберите клетки центрифугированием при 1,360 G в течение 10 минут. Резонатор суспендирует клетки в дистиллированной воде так, чтобы итоговый OD составил 0,2. Этот od соответствует от 10 до восьми колониеобразующих единиц на миллилитр.

Когда бактерии готовы, приступайте к подготовке листьев и проведите анализ на окрашивание листьев. Сначала приготовьте 20 микромолярный раствор пропидиума, йодида или PI в воде. 10 миллилитров раствора достаточно, чтобы запачкать три небольших листочка за один раз.

Извлеките растения из камеры роста и с помощью щипцов отделите три молодых полностью раскрывшихся листа. Погрузите целые листья в раствор PI на пять минут. Затем удалите листья и кратко промойте их дистиллированной водой.

Далее поместите лист нижней поверхностью вниз на предметное стекло микроскопа. Разрежьте лист острым лезвием бритвы на четыре части, исключая среднюю жилку, чтобы лист лежал плашмя на предметном стекле для инкубации бактерий с листьями. Добавьте 300 микролитров бактериальной суспензии под кусочки листьев на предметном стекле, следите за тем, чтобы нижняя поверхность листа соприкасалась с инокулянтом.

Инкубируйте образцы в тех же условиях окружающей среды, которые использовались для выращивания растений. Когда придет время рассмотреть листья под микроскопом, переложите кусочки листьев на новое предметное стекло нижней поверхностью вверх. Обратите внимание, что при монтаже направляющих не используется защитное накладка.

Один и тот же образец листа может быть сфотографирован несколько раз в течение инкубации, и временной ход может быть установлен в соответствии с целями исследования. Здесь лазерный сканирующий конфокальный микроскоп используется для изучения листьев, наблюдения за нижней поверхностью листьев для обнаружения флуоресценции PI с использованием тех же образцов листьев, получения изображений устьиц с течением времени. Сохраните изображения для измерения ширины устьичной апертуры.

Измеряйте ширину устьичного отверстия не менее 60 стомы для каждой процедуры в каждый момент времени. С помощью браузера изображений LSM рассчитайте среднюю и стандартную погрешность для ширины устьичной апертуры. Статистическая значимость результатов может быть рассчитана с использованием двухвостых парных мудрецов.

Т-тест здесь представляет собой типичное микроскопическое изображение поверхности листа арабидопсиса под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. В светлом поле йодид пропидида окрашивает клеточную стенку жизнеспособных клеток, увеличивая видимость защитных клеток, а также позволяя идентифицировать неповрежденные клетки. На этих микрофотографиях можно увидеть ряд устьичных отверстий ПО, от полностью закрытой стомы до широко открытой стомы.

Полностью закрытые стомы идентифицируются по форме защитных клеток. Шириной апертуры считается ноль микрометров для открытой стомы. Отображаемая ширина апертуры измеряется с помощью прямой линии, проведенной по самой широкой области поры стомы.

Таковы типичные экспериментальные результаты посевного анализа живых листьев. Листья арабидопсиса инкубировали в темноте с тремя различными штаммами псевдомонады Cy Ringe, только бактерия P-S-T-D-C 3000 смогла открыть темную стому кло, что измерялось шириной апертуры 60 случайно выбранных устьиц на штамм бактерий. Этот метод проложил путь исследователям в области плановых взаимодействий бактерий к изучению механизмов ранней реакции на патогены у видов растений.