Оценка Цены Вирус Производство в водных системах

Общая цель данной процедуры заключается в определении скорости продукции вирусов в водных микробных сообществах. Это достигается путем предварительного снижения численности свободных вирусов в исследуемом образце при сохранении нативного микробного сообщества. Вторым этапом процедуры является инкубация образцов в условиях, стимулирующих продукцию, с последующим отбором субобразцов каждые два-три часа на протяжении до 10 часов.

Третьим этапом процедуры является подсчет количества вирусов в собранных подпробах для каждой временной точки. Заключительным этапом процедуры является определение скорости увеличения численности вирусных частиц в пробе и расчет скорости продукции вирусов. В итоге на основании данных подсчета можно получить результаты, демонстрирующие скорость продукции вирусов в микробном сообществе, что позволяет исследователям сделать вывод о скорости гибели микроорганизмов вследствие вирусной активности.

Всем привет. Меня зовут Одри Мэдисон, я работаю в лаборатории доктора Стивена Милхэма на кафедре микробиологии Университета Теннесси. Сегодня с помощью Чарльза Бадоффа и Клэр Кэмпбелл мы продемонстрируем вам процедуру анализа скорости продукции вирусов в водных системах.

Для этого мы уменьшаем количество свободных вирусов в образцах и подсчитываем скорость их повторного появления в результате лизиса инфицированных вирусом микроорганизмов. В настоящее время мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения экологии вирусов и того, как они могут формировать микробные сообщества. Теперь, когда мы представили метод, давайте приступим к работе.

Перед началом данной процедуры соберите примерно 20 литров морской воды, соблюдая максимальную асептику. После сбора образца проведите предварительную фильтрацию воды через фильтр с диаметром 142 мм и размером пор 0.8 мкм. Для биологически продуктивных систем перед этим можно выполнить фильтрацию через фильтр с бóльшим размером пор или стекловолоконный фильтр.

Для получения ультрафильтрованной воды установите систему ультрафильтрации, например, систему AmCon M 12 со спирально-навитой мембранным картриджем для удаления всех вирусов. Затем вирусы в образце удаляются и концентрируются при скорости примерно 25% от максимальной и противодавлении от 15 до 16 kilo pascals. В ретентате объемом около 500 milliliters теперь содержится концентрированная совокупность вирусов, которую можно сохранить для других исследований, в то время как свободный от вирусов пермеат будет использован для анализов по продукции вирусов.

После каждого дня использования очищайте систему Omicron M 12, чтобы предотвратить повреждение мембраны фильтрующего картриджа. При работе с морской водой промывайте мембрану не менее чем шестью литрами воды Milli Q, после чего промойте ее 0,1 молярным раствором гидроксида натрия в течение 30–45 минут. Затем повторно промойте картридж не менее чем шестью литрами воды Milli Q.

По завершении работы спиральный картридж можно хранить в 0,05 молярном растворе фосфорной кислоты при температуре четырех градусов Цельсия. Чтобы начать метод снижения вирусной нагрузки, 500 миллилитров пробы морской воды, взятой из того же места, где была получена вода, свободная от вирусов, помещают в установку для стерильной фильтрации с фильтром с низким связыванием белков и номинальным размером пор 0,2 микрона. На этом этапе также следует отобрать подпробу для определения общего содержания вирусов и бактерий в исходной воде.

Осторожно создайте вакуумное давление в образце менее 200 миллиметров ртутного столба, постоянно ресуспендируя образец с помощью стерильной переносной пипетки, чтобы предотвратить концентрирование бактериальных клеток на фильтре; медленно добавьте три объема (500 миллилитров) ультрафильтрата к бактериальной суспензии, чтобы снизить количество свободных вирусов в образце, поддерживая при этом бактериальные популяции при постоянной плотности. В завершение разбавьте бактериальную фракцию до 500 миллилитров ультрафильтрованной водой, не содержащей вирусов. Затем разделите ее на три повторности по 150 миллилитров и поместите их в прозрачные поликарбонатные флаконы объемом 250 миллилитров.

Это представляет собой ваш набор образцов в момент времени ноль. Возьмите пробы из образцов момента времени ноль для оценки численности бактерий и вирусов. Перенесите образцы в криопробирки с конечной концентрацией стерильного глутаральдегида 2,0–2,5%.

Для фиксации образцы следует немедленно подвергнуть мгновенной заморозке в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C до момента анализа. В качестве альтернативы для концентрирования морских микробов можно использовать систему тангенциальной фильтрации. Для применения метода TFF возьмите примерно 500 milliliters природного образца.

Сконцентрируйте данный образец с помощью системы тангенциальной фильтрации с номинальным размером пор 0,2 мкм до тех пор, пока объем бактериальной фракции не сократится примерно до 10–15 мл, используя ультрафильтрованную воду, очищенную от вирусов, как описано в методе снижения содержания вирусов; инкубируйте полученные повторные флаконы в условиях in situ. Для этого мы используем климатические камеры, представляющие собой инкубаторы с протоком морской воды, подключенные к источнику поверхностных вод для поддержания температуры окружающей среды. Уровни освещенности можно привести в соответствие с поверхностными условиями, используя акрил с синим оттенком или сетку с нейтральным светофильтром для снижения интенсивности света.

При работе на полевой станции или в лаборатории, а также в случаях, когда морская вода недоступна для проточной подачи, можно использовать инкубатор для выращивания с освещением. Продолжайте отбирать субпробы каждые 2,5 часа на протяжении как минимум 10 часов, используя метод, примененный для пробы в момент времени ноль. Помимо образцов для микроскопии, некоторым исследователям может потребоваться собрать воду для количественного ПЦР-анализа на специфические вирусы.

Для образцов, предназначенных для количественной ПЦР (QPCR), добавьте 5 мл образца в криопробирку без фиксирующего агента и немедленно подвергните быстрому замораживанию в жидком азоте. Перед проведением микроскопии вирусного производства разморозьте замороженные образцы на льду и приготовьте свежие растворы согласно описанному в письменном протоколе методу. Затем поместите дисковый фильтр диаметром 25 мм с размером пор 0,02 мкм поверх целлюлозного поддерживающего фильтра с размером пор 0,45 мкм. После этого добавьте 850 µL фиксированного образца на верхний фильтр и подвергните вакуумированию при давлении менее 20 kPa до полного высыхания.

Когда фильтр с анодиском высохнет, дозированно внесите 100 µL рабочего раствора Cyber Green в стерильную чашку Петри. Не выключая вакуумный насос, осторожно извлеките анодиск из фильтрационной колонки и поместите его в раствор Cyber Green. Инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут.

Осторожно извлеките фильтр из раствора cyber green и промокните его обратную сторону салфеткой Kim wipe, чтобы удалить все остатки красителя. Затем нанесите небольшую каплю раствора Antifa на предметное стекло и накройте его покровным стеклом. Снимите покровное стекло и поместите высушенный фильтр на предметное стекло.

Снова добавьте небольшое количество раствора Antifa на покровное стекло и медленно поместите его поверх фильтра, стараясь удалить все возможные пузырьки воздуха. Подсчитайте количество вирусов с помощью флуоресцентной микроскопии с широкополосным синим фильтром; проанализируйте не менее 20 полей зрения для каждого фильтра, количественно определяя общее число вирусов в каждой области сетки, чтобы обеспечить равномерное распределение вирусов по мембране фильтра. Рассчитайте средние показатели восстановления вирусов по трем независимым повторностям и определите стандартное отклонение для скоростей продукции. В завершение скорректируйте эти показатели с учетом разведения микроорганизмов от исходного содержания до разбавленного содержания в образце с уменьшенным количеством вирусов.

Основным набором данных, полученным в результате этого исследования, являются показатели частоты рецидивов содержания вирусов в подпробах из инкубаций. Эти результаты представляют собой независимые регрессии зависимости содержания вирусов от времени для каждого из образцов. Процесс продукции вирусоподобных частиц контролировали в течение 10 часов инкубации в условиях in situ с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.

Эти образцы были собраны во время цветения фитопланктона у побережья Новой Зеландии в сентябре 2008 года. Мы только что продемонстрировали способ оценки скорости продукции вирусов. Этот процесс включает использование различных систем ультрафильтрации и проведение экспериментов по измерению скорости продукции вирусов.

Кроме того, мы продемонстрировали вам способ подсчета этих вирусов с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости использовать чистое оборудование, осторожно обращаться с окрашенными вирусами, ограничить воздействие света, быстро обрабатывать образцы и тщательно очищать ультрафильтрационные картриджи после каждого использования. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.