Конкретные Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток использованием Rev-зависимый лентивирусов Векторный выражая зеленый флуоресцентный белок
23 сентября 2010 г.
Мы разработали лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, Rev-ответ элементов (РРЭ), которые могут регулируют экспрессию гена-репортера в ВИЧ-1 Tat и Rev-зависимым способом. Вектор разрешения специфической детекции репликации ВИЧ в живых клетках с помощью выражения GFP.
Общая цель данной процедуры заключается в идентификации ВИЧ-положительных клеток с использованием лентивирусного вектора ВИЧ-1, зависящего от Rev и несущего зеленый флуоресцентный белок. Это достигается путем предварительного получения Rev-зависимых лентивирусных частиц посредством котрансфекции. Вторым этапом процедуры является инфицирование Т-лимфоцитов человека CD4 ВИЧ-1.
Затем ВИЧ-положительные CD4+ Т-клетки человека подвергаются суперинфекции лентивирусными частицами, несущими ген GFP. Заключительным этапом является идентификация ВИЧ-положительных клеток путем измерения количества GFP-положительных клеток с помощью проточной цитометрии. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие процент GFP-положительных клеток, определенный методом проточной цитометрии.
Значение данного метода распространяется на терапию ВИЧ-инфекции, так как rev-зависимый вектор может доставлять и селективно экспрессировать терапевтические гены в ВИЧ-инфицированных клетках для индукции гибели ВИЧ-положительных клеток. Процедуру продемонстрирует исследователь, адъюнкт-профессор нашей лаборатории. Для получения rev-зависимых лентивирусных частиц клетки HEK 293T трансфецируют тремя плазмидами: rev-зависимым лентивирусным вектором GFP, упаковочной конструкцией ВИЧ-1 и плазмидой, несущей гликопротеин VSVG. За один день до трансфекции плазмидами высейте 2 × 10⁶ клеток HEK 293T в 10 мл среды.
В чашке Петри диаметром 100 mm культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На следующий день замените супернатант клеток на 5 mL свежей среды.
Затем продолжайте культивировать клетки в течение четырех часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. Подготовьте реагенты для трансфекции до завершения четырехчасовой инкубации. Клетки HEK 2 93 T будут трансфецированы тремя плазмидами в соотношении: 10 µg rev-зависимого лентивирусного вектора GFP, 7.5 µg упаковочной конструкции HIV one и 2.5 µg гликопротеина VSVG.
Сначала предварительно смешайте три плазмидных ДНК в нужном соотношении. Затем подготовьте две полистирольные пробирки объемом 5 мл. Добавьте по 480 µL 2-кратного буфера HBS в первую и вторую пробирки.
Добавьте 60 µL 2 M буфера хлорида кальция к плазмидным ДНК и буферу для трансфекции до достижения общего объема 480 µL. Затем по каплям добавьте смесь плазмидной ДНК с хлоридом кальция в пробирку с 2× HPS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
Постепенно образуется мелкодисперсный осадок. Теперь по каплям с помощью пипетки добавьте все 960 µL смеси к клеткам HEK 2 9 3 T. Инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение ночи.
На следующий день удалите супернатант и добавьте 10 ml свежей среды. Снова инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи. Через 48 часов после трансфекции соберите вирус, удалив супернатант и перенеся его в стерильную пробирку объемом 50 ml.
Добавьте 10 milliliters свежей среды в чашку Петри и продолжайте культивирование в течение ночи. Храните супернатант вируса при температуре four degrees Celsius. Продолжите сбор через 72 hours после трансфекции, собрав супернатант и объединив его с ранее собранным супернатантом.
Затем центрифугируйте супернатант S при 500 ×g в течение 15 минут для осаждения и удаления клеточного дебриса. После центрифугирования соберите супернатант S и перенесите его в новую пробирку. Затем профильтруйте супернатант через мембранный фильтр Millipore с порами 0.22 µm.
Вирус будет дополнительно концентрирован с помощью колонки для эксклюзионной хроматографии; далее будет продемонстрирован процесс концентрирования вирусных частиц. Нанесите вирусный супернатант на колонку для эксклюзионной хроматографии и центрифугируйте при 6,000 ×g при температуре 4 °C в течение 15 минут. Соберите концентрированный вирусный супернатант, отделив около 100 µL для определения титра вируса.
Разделите оставшийся объем на аликвоты и храните при температуре -80 °C. Определение вирусного титра является одним из наиболее важных аспектов данной процедуры. Для эффективного заражения клеток вектором GFP VIR требуется более высокая множественность заражения.
Для определения вирусного титра необходимо получить процент GFP-положительных клеток, определяемый методом проточной цитометрии. Линия клеток JER-Cat, положительных по HIV-1 и обработанных TNF, будет инфицирована вирусным супернатантом. Эти HIV-1-положительные клетки подвергаются культивированию.
В 96-луночном планшете при концентрации 2,5 × 10⁵ клеток на мл в общем объеме 100 µL. Приготовьте шесть десятикратных серийных разведений rev-зависимых лентивирусных частиц для инфицирования HIV-1-положительных клеток; добавьте по 100 µL каждого серийного разведения вируса в каждую лунку с клетками. Инкубируйте в CO₂-инкубаторе при 37 °C в течение семи дней.
Титр частиц оценивают путем наблюдения за GFP-положительными клетками под флуоресцентным микроскопом. Расчеты проводятся по методу Reid и MU, а титр определяется как точка разведения, которая приводит к появлению GFP-положительных лунок. В 50% лунок, инфицированных по схеме IV, наблюдались положительные клетки с rev-зависимыми лентивирусными частицами.
Сначала линию Т-клеток CD4 человека инфицируют вирусом ВИЧ-1. Для каждого заражения используют 2 × 10⁵ клеток. За два часа до инфицирования.
Добавьте poly brain в клетки до конечной концентрации 4 µg/mL. Инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. Затем инфицируйте клетки, pipetтируя раствор ВИЧ в одну из пробирок объемом 5 mL.
Другие две пробирки с клетками не инфицируют; они будут служить в качестве контролей. Инкубируйте все клетки при 37 °C в течение двух часов. Через два часа центрифугируйте клетки при 300 ×g в течение 10 минут, удалите свободный от клеток вирус, слив супернатант, и ресуспендируйте клетки в свежей среде до концентрации 2 × 10⁵ клеток/мл. Культивируйте при 37 °C в течение 48 часов.
Через 48 часов клетки, инфицированные ВИЧ, готовы к заражению. Для инфицирования rev-зависимыми лентивирусными частицами используйте 2 × 10⁵ клеток, добавляя 100 µL лентивирусных частиц к клеткам, инфицированным ВИЧ V1; в качестве контроля клетки человека CD4 T, не инфицированные ВИЧ V1, также инфицируют 100 µL лентивирусных частиц. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи, после чего переходите к следующему этапу на следующий день.
Замените отработанную среду на свежую и ресуспендируйте клетки до концентрации 2 × 10⁵ клеток/мл. Через 48 часов после заражения осадите клетки центрифугированием, затем ресуспендируйте их в 500 µL 1% параформальдегида и перенесите полученную суспензию в пробирку для проточной цитометрии. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре клетки можно проанализировать на анализаторе FACS на наличие экспрессии GFP.
При успешном проведении экспериментов лентивирусный вектор V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A, зависимый от обратной транскриптазы, позволит высокоспецифично определять реплицирующийся ВИЧ в популяциях живых клеток путем измерения экспрессии зеленого флуоресцентного белка GFP. В данном примере собранные клетки C-E-M-S-S окрашивали с помощью меченого PE крысиного моноклонального антитела к мышиному CD 24 HSA, после чего анализировали на проточном цитометре экспрессию как HSA, так и GFP, как показано здесь. Значительная популяция GFP-положительных клеток была обнаружена в клетках, инфицированных ВИЧ-1 и суперинфицированных V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.
Напротив, GFP-положительные клетки не были обнаружены ни в неинфицированных ВИЧ-1 клетках C-E-M-S-S без лентивирусной суперинфекции, ни в неинфицированных ВИЧ-1 клетках с лентивирусной суперинфекцией. Не забывайте, что работа с ВИЧ может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, соответствующие уровням биологической безопасности.
Обзор
В данном исследовании представлен новый лентивирусный вектор, предназначенный для обнаружения ВИЧ-положительных клеток посредством экспрессии GFP, зависящей от белков Tat и Rev ВИЧ-1. Этот метод позволяет идентифицировать реплицирующийся ВИЧ в живых клетках, что имеет важное значение для терапевтического применения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Вирусология
- Генная терапия
Теоретические сведения
- Инфекция ВИЧ остается одной из главных проблем здравоохранения во всем мире.
- Современные методы обнаружения ВИЧ-положительных клеток ограничены.
- Лентивирусные векторы могут быть сконструированы для специфической экспрессии генов.
- Элемент ответа Rev (RRE) повышает специфичность обнаружения.
Цель исследования
- Разработать лентивирусный вектор, позволяющий обнаруживать ВИЧ-положительные клетки.
- Использовать экспрессию GFP в качестве маркера для идентификации инфицированных клеток.
- Изучить терапевтические возможности применения данного вектора при лечении ВИЧ.
Используемые методы
- Котрансфекция клеток HEK 293T для получения лентивирусных частиц.
- Инфицирование Т-клеток человека CD4 ВИЧ-1 с последующей суперинфекцией лентивирусным вектором.
- Проточная цитометрия для измерения количества GFP-положительных клеток.
- Определение вирусного титра путем серийных разведений и наблюдения за GFP.
Основные результаты
- Успешное получение Rev-зависимых лентивирусных частиц.
- Идентификация ВИЧ-положительных клеток по экспрессии GFP.
- Результаты проточной цитометрии показали количественно определенный процент инфицированных клеток.
- Вектор продемонстрировал потенциал для доставки терапевтических генов.
Выводы
- Разработанный лентивирусный вектор эффективен для обнаружения ВИЧ-положительных клеток.
- Данный метод может улучшить терапевтические стратегии лечения ВИЧ-инфекции.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на оптимизации вектора для применения в генной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет с высокой специфичностью обнаруживать реплицирующийся ВИЧ в популяциях живых клеток, решая ключевую проблему валидации мишеней противовирусных препаратов, при которой неспецифическая активность репортера затрудняет механистическую интерпретацию. Благодаря связыванию экспрессии GFP с зависимостью от белков Tat и Rev, вектор снижает количество ложноположительных результатов, вызванных состояниями клеточной активации, что повышает прогностическую достоверность при скрининге терапевтических средств против ВИЧ на ранних стадиях. Этот подход способствует снижению рисков при изучении механизмов действия за счет обеспечения количественного флуоресцентного считывания для оценки влияния соединений на циклы репликации вируса.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать ВИЧ-специфическую транскрипционную и посттранскрипционную регуляцию с помощью двойной Tat/Rev-зависимой экспрессии репортеров.
- Практическая ценность: снижает фоновый шум по сравнению с векторами, содержащими только LTR, что повышает специфичность анализа при кампаниях по валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации соединений, которые нарушают Rev-зависимый экспорт или поздние стадии репликации вируса.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественный, совместимый с проточной цитометрией метод считывания для измерения числа GFP-положительных клеток в качестве индикатора репликации ВИЧ.
- Практическая ценность: Позволяет реализовать стандартизированные, воспроизводимые рабочие процессы инфицирования и суперинфицирования в моделях CD4+ Т-клеток.
- Масштабируемость: Определение вирусного титра методом серийных разведений обеспечивает нормализацию анализа на всех скрининговых планшетах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает раннее обнаружение HIV-положительных клеток с последующей терапевтической доставкой генов в рамках одной векторной системы.
- Механистическое снижение рисков: позволяет оценить, снижают ли исследуемые соединения сигнал GFP за счет ингибирования репликации, а не из-за цитотоксичности.
- Релевантная заболеванию система: использует суперинфицированные CD4+ T-клетки человека для моделирования физиологически значимых условий репликации HIV.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в общий цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущего соединения, при этом специфическое обнаружение реплицирующегося вируса позволяет изучать механизмы действия и принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на основе снижения сигнала GFP.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез о взаимодействии ВИЧ с факторами хозяина и функциях вирусных генов посредством регулируемой экспрессии репортера.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет количественно определяемой экспрессии GFP, которая детектируется методом проточной цитометрии после суперинфекции.
- Аналитика: позволяет получать результаты в процентах GFP-положительных клеток для сравнения различных условий обработки и вирусных титров.
- Трансляционные исследования: связывают возможности детекции с терапевтическим потенциалом за счет доставки эффекторных генов с помощью того же вектора.
- Прикладное использование: платформу можно адаптировать для других РНК-вирусов путем замены регуляторных элементов при сохранении конструкции с двойной зависимостью.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет разграничения истинных HIV-зависимых сигналов и артефактов клеточной активации.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочий процесс детекции с использованием производства лентивирусов, титрования и анализа методом проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет сокращения числа ложноположительных результатов в каскадах скрининга противовирусных препаратов.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе измеримого снижения сигнала реплицирующегося вируса.
Особенности реализации
- Требуется опыт в производстве лентивирусных векторов, знание протоколов биобезопасности при работе с ВИЧ и навыки работы с проточным цитометром.
- Необходим доступ к клеткам HEK 293T для упаковки вируса и моделям человеческих CD4+ T-клеток для инфицирования.
- Требуется стандартизация времени суперинфицирования и количественного определения вирусного титра между различными лабораториями.
- Адаптация метода для первичных клеток или альтернативных моделей может потребовать оптимизации эффективности инфицирования и активности промотора.
- Практическое ограничение: сигнал зависит от активной экспрессии Rev, что может не позволить зафиксировать латентные или ранние стадии после интеграции.
