Сотовые к клетке высокомолекулярных транспорта Пробирной В Планта Используя Biolistic Бомбардировка

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе степени перемещения флуоресцентно меченого белка между клетками эпидермиса растения. Это достигается путем получения частиц золота, покрытых ДНК, для транзиентной экспрессии интересующего слитого белка в эпидермисе растения. На втором этапе ДНК доставляется в эпидермис растения, что обеспечивает экспрессию и перемещение исследуемого слитого белка.

Затем экспрессированный слитый белок исследуют с помощью конфокального микроскопа, чтобы проследить за экспрессией и локализацией тестируемых белков с флуоресцентными метками. В результате анализа распределения флуоресцентного сигнала методом конфокальной микроскопии определяют степень транспорта флуоресцентно меченого белка из клетки в клетку. Здравствуйте, я Бен Майерс из лаборатории KY кафедры биохимии и клеточной биологии Государственного университета Нью-Йорка в Стоуни-Брук.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа степени перемещения флуоресцентно меченных белков из клетки в клетку в эпидермисе растений. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения межклеточного транспорта белков перемещения растительных вирусов на различных генетических фонах растений, а также для сравнения межклеточной мобильности белков разных типов. Итак, приступим.

Для начала выполнения данного протокола вырастите одно растение arabidopsis на субстрате Promix bx. В горшке подходящего размера используйте камеру с контролируемыми условиями среды, коротким фотопериодом и относительной влажностью от 40 до 65%. Для растений nicotiana hamana и nicotiana tobacco вырастите каждое растение на субстрате Promix BX в горшке большего размера. Аналогично обеспечьте камеру с контролируемыми условиями среды, длинным фотопериодом и относительной влажностью от 40 до 65%.

Периодически подкармливайте растение доступными в продаже удобрениями, как было описано ранее. После выращивания растения Opsis в течение шести-восьми недель выберите для эксперимента листья размером более 15 мм на 35 мм, где измерение длины включает черешок. Для растений n benanna и NAC период выращивания составляет от семи до 10 недель. Затем выберите листья размером более 50 мм на 70 мм для end benanna и 100 мм на 125 мм для NAC.

В этих случаях измерения длины не включают пеолы. Перед началом доставки ДНК-покрытых микрочастиц методом BIC подготовьте картридж генной пушки с ДНК-покрытыми золотыми микрочастицами, как было подробно описано ранее. Затем удалите листья одной и той же стадии развития острым лезвием бритвы и немедленно поместите их стороной AAL вверх на плоскую поверхность из пенополистирола.

Абаксиальная сторона листа является более подходящим субстратом для бомбардировки из-за более низкой плотности трихом и более тонкой кутикулы. Малые листья, такие как у rapid opsis, можно зафиксировать, накрыв их фрагментом оконной москитной сетки и закрепив сетку канцелярскими кнопками к поверхности пенополистирола. Располагайте листья ровно, чтобы повысить эффективность доставки частиц и минимизировать повреждение тканей при микробомбардировке.

Затем вставьте в пистолет картридж с микрочастицами, покрытыми ДНК. Для кролика проведите облучение при давлении от 140 до 160 PSI для микрочастиц размером 0.6 micron.

Проведите бомбардировку образца, используя по одному картриджу на лист, чтобы распределить микрочастицы по площади поверхности диаметром от 10 до 12 миллиметров. Для end benanna и end baum. Осуществляйте обстрел при давлении от 160 до 180 PSI для микрочастиц размером 0,6 микрон при работе с более крупными листьями end benanna и end tobacco.

Допускается многократная бомбардировка одного и того же листа, однако она должна проводиться в симметричных точках по обе стороны от центральной жилки, чтобы воздействие приходилось на участки листа, находящиеся на одной стадии развития. Флуоресцентный сигнал транзиентно экспрессированных меченых белков визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. Необходимо тщательно подобрать оптимальные настройки микроскопа для детекции каждого исследуемого белка.

Используйте объектив с увеличением 40x для наблюдения белков с ограниченным внутриклеточным накоплением и слабой интенсивностью сигнала, таких как белок перемещения вируса табачной мозаики (T-M-V-M-P) при его локализации в плазменном десаль. Это обеспечивает более высокое разрешение и повышенную чувствительность. Однако для более быстрого получения изображений белков с цитоплазматическим распределением и сильной интенсивностью сигнала, таких как свободный желтый флуоресцентный белок (YFP), можно использовать объектив 10x с функцией конфокального зума. О простом транспорте судят по появлению многоклеточных кластеров, содержащих флуоресцентный сигнал.

Количество таких кластеров и число клеток в каждом из них указывают на степень межклеточного транспорта. Для получения достоверных данных зарегистрируйте не менее 100 экспрессирующих кластеров на одну экспериментальную систему; при этом следует проводить эксперименты одновременно.

Когда будут проведены сравнения. В данном случае была зафиксирована упрощенная транспортировка белков с флуоресцентной меткой. Представлены типичные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа после микробомбардировки листа end hamana конструктом, экспрессирующим TMV mp YFP.

Упрощенное перемещение TMV MP YFP наблюдается по появлению многоклеточных кластеров YFP-сигнала. Однако не весь транзиентно экспрессируемый TMV MP YFP способен к перемещению, о чем свидетельствует сигнал в отдельных клетках при некоторых микробомбардировках.

Статистически в менее чем 40% подсчитанных кластеров сигналов TMV MP YFP не способен перемещаться между клетками. В то время как в более чем 60% кластеров белок перемещается между двумя и пятью клетками. Поскольку распространение на две клетки встречается чаще всего, белки с относительно небольшим молекулярным размером и отсутствием собственной двигательной активности могут диффундировать через плазматические SMA для перемещения из клетки в клетку.

Например, свободный YFP или один XYFP распространяется между несколькими клетками и обнаруживается в более чем 30% подсчитанных кластеров. Напротив, такая неспецифическая диффузия не наблюдается для трансляционного димера YFP или двух XYFP, размер которых сопоставим с размером слитого белка TMV MP YFP и которые проявляют полную клеточную автономность. Мы только что продемонстрировали вам способ анализа перемещения флуоресцентно меченных белков из клетки в клетку с использованием транзиентной экспрессии с помощью системы генной пушки в эпидермисе растений.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости подготовки здоровых, жизнеспособных растений, использования высококачественных золотых частиц с нанесенной ДНК для доставки генетического материала, а также анализа достаточного количества экспрессионных кластеров для получения статистически достоверных результатов. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.