Сотовые к клетке высокомолекулярных транспорта Пробирной В Планта Используя Biolistic Бомбардировка

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе степени межклеточного перемещения флуоресцентно меченого белка в эпидермисе растений. Это достигается за счет получения покрытых ДНК частиц золота для экспрессии представляющего интерес белка слияния в эпидермисе растений. На втором этапе ДНК доставляется в эпидермис растения, что позволяет экспрессировать и перемещать тестируемый гибридный белок.

Затем за экспрессированным гибридным белком наблюдают под конфокальным микроскопом с целью мониторинга экспрессии и локализации тестируемых белков, помеченных флуоресцентными метками. Получены результаты, показывающие степень межклеточного транспорта флуоресцентно меченного белка на основе анализа распределения флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной микроскопии. Здравствуйте, я Бен Майерс из лаборатории Кентукки на факультете биохимии и клеточной биологии Государственного университета Нью-Йорка в Стоуни-Брук.

Сегодня мы покажем вам процедуру анализа степени межклеточного перемещения или флуоресцентно меченного белка в эпидермисе растений. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения межклеточного транспорта белков перемещения вирусов растений на различных растительных фонах и для сравнения межклеточной подвижности различных типов белков. Итак, приступим.

Чтобы начать этот протокол, вырастите одно растение арабидопсиса на Promix bx. В горшке подходящего размера используйте камеру с контролируемой окружающей средой с коротким периодом фотосъемки и относительной влажностью от 40 до 65% для растений табака никотиана, хамана и никотиана. Опять же, обеспечьте камеру с контролируемой средой с длительным периодом фотосъемки и относительной влажностью от 40 до 65%.

Время от времени удобряйте растение коммерчески доступными продуктами, как описано ранее. После выращивания растения Opsis в течение шести-восьми недель выберите листья для эксперимента размером более 15 на 35 миллиметров, где измерение длины включает в себя peole для растений n benanna, а растения NAC выращивают растения в течение 7-10 недель. Затем выберите листья размером более 50 миллиметров на 70 миллиметров для торцевой бенанны и 100 миллиметров на 125 миллиметров для nac.

В этих случаях измерения длины не включают peole. Перед проведением BIC доставки микрочастиц, покрытых ДНК, можно начинать подготовку картриджа генной пушки с покрытыми ДНК микрочастицами золота, как это было подробно описано ранее. Затем удалите листья той же стадии развития острым лезвием бритвы и сразу же положите их сторонами AAL вверх на плоскую поверхность из пенополистирола.

Сторона листа ABA представляет собой лучший субстрат для бомбардировки из-за более низкой плотности и более тонкой кутикулы. Мелкие листья, такие как рапид опсис, можно обездвижить, накрыв куском оконной сетки и закрепив сетку булавками к поверхности пенополистирола. Держите листья плоскими, чтобы повысить эффективность доставки частиц и свести к минимуму повреждение тканей во время микробомбардировки.

Затем вставьте в пистолет картридж с микрочастицами, покрытыми ДНК. Для опсиса кролика. Выполняйте съемку при давлении от 140 до 160 фунтов на квадратный дюйм для микрочастиц размером 0,6 микрона.

Бомбардируйте образец, используя один картридж на лист, чтобы распределить микрочастицы по площади поверхности от 10 до 12 миллиметров в диаметре. Для энда бенанна и энд баум. Стреляйте при давлении от 160 до 180 фунтов на квадратный дюйм для микрочастиц размером 0,6 мкм с более крупными концевыми бенанными и концевыми табачными листьями.

Возможны множественные бомбардировки одного и того же листа, однако они должны выполняться в симметричных положениях с каждой стороны средней жилки, чтобы нацелиться на области листа на одной и той же стадии развития. Флуоресцентный сигнал транзиторно экспрессируемых меченых белков визуализируется с помощью конфокалов. При микроскопии следует уделять особое внимание поиску оптимальных настроек микроскопии для обнаружения каждого исследуемого белка.

Используйте объектив с 40-кратным увеличением для наблюдения за белками, которые демонстрируют ограниченное внутриклеточное накопление со слабой интенсивностью сигнала, такие как плазменная локализация десала вируса табачной мозаики, двигательный белок или T-M-V-M-P. Это обеспечивает более высокое разрешение и повышенную чувствительность. Тем не менее, объектив с 10-кратным увеличением и функцией конфокального зума может быть использован для более быстрой визуализации белков, которые демонстрируют цитоплазматическое распределение с высокой интенсивностью сигнала, таких как свободный желтый флуоресцентный белок или YFP. Упрощенный транспорт выводится из появления многоклеточных кластеров, содержащих флуоресцентный сигнал.

Количество таких кластеров и количество клеток в каждом кластере указывает на степень межклеточного транспорта. Для получения достоверных данных запишите не менее 100 выражений. Кластеры на экспериментальную систему, позаботьтесь о том, чтобы проводить эксперименты одновременно.

Когда будут проведены сравнения. Здесь был обнаружен упрощенный транспорт флуоресцентно меченных белков. Показаны типичные конфокальные изображения, полученные после микробомбардировки конечного листа хамана экспрессирующей конструкцией A TMV mp YFP.

Наблюдается упрощенное движение TMV MP YFP на основе появления многоклеточных кластеров сигнала YFP. Однако не все транзиторно экспрессируемые TMV MP YFP способны двигаться, о чем свидетельствует сигнал одной клетки. В некоторых микробомбардировках.

Статистически менее чем в 40% подсчитанных кластеров сигналов TMV MP YFP не может перемещаться между клетками. В то время как в более чем 60% кластеров белок перемещается между двумя и пятью клетками. Поскольку распространение двух клеток происходит наиболее часто, белки с относительно небольшим размером молекул без врожденной активности движения могут диффундировать через плазменную СМА для перемещения от клетки к клетке.

Например, свободный YFP или один XYFP распространяется между несколькими ячейками и превышает 30% подсчитанных кластеров. И наоборот, эта неспецифическая диффузия не происходит для трансляционного димера YFP или двух XYFP, которые по размеру сопоставимы с гибридным белком TMV MP YFP и являются полностью автономными клетками. Мы только что показали вам, как анализировать межклеточное перемещение флуоресцентно меченных белков с помощью экспрессии переходных процессов с помощью системы генной пушки в эпидермисе растений.

При выполнении этой процедуры важно помнить о подготовке здоровых, крепких растений, высококачественных золотых частиц, покрытых ДНК, для доставки ДНК и анализе достаточного количества кластеров экспрессии для получения статистически достоверных результатов. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.