Name: Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Узнайте метод выделения стволовых клеток сетчатки из цилиарного эпителия глаза мыши. Этот подход позволяет культивировать клональные сферы для изучения регенеративного потенциала.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим Лаура Кларк за ее неоценимую помощь. Эта работа проводится при поддержке NCE: Стволовые клетки сети, CIHR и NIH.

1. Подготовка Пройдя Решения и ферментов Решения <ol><li> Сделать искусственное спинно-мозговой жидкости (ACSF) и сыворотки среде заранее и поставить в холодильник. </li><li> Отвешивать кинуреновой кислота (0,2 мг / мл) и растворяют в 10 мл Хило ACSF в 37 ° С водяной бане заранее, поскольку она не растворяются. </li><li> Отвешивать трипсина (1,33 мг / мл) и гиалуронидазы (0,67 мг / мл) и место в одном 15 мл трубку и держать его при температуре -20 ° C до необходимости. Добавить кинуреновой раствора кислоты на эту трубу и фильтр, используя шприц 22 мкм фильтр непосредственно перед использованием. </li><li> Отвешивать ингибитор трипсина (Ovamucoid: 1 мг / мл) и растворяют в теплой сыворотки среде и фильтр, используя 22μm фильтр шприца. </li><li> Сделать покрытие СМИ: сыворотки среде содержащей FGF2 (10 нг / мл) и гепарин (2 мкг / мл). </li></ol> 2. Изоляция стволовых клеток сетчатки от мыши глаз <ol><li> Выделение стволовых клеток сетчатки выполняется в конкретных стерильной комната, посвященная первичных экспериментов культуры. Перед началом этой процедуры, создать микроскоп и рассекает холодный источник света, а затем выложить стерильной рассекающих инструментов. Каждый вытяжки горячего бусинка стерилизатор для стерилизации инструментов между шагами. </li><li> Мы будем изолировать стволовые клетки сетчатки от глаз, которые были размещены непосредственно в стерильную чашку Петри, содержащих искусственные спинно-мозговой жидкости (ACSF) после их удаления из мышей, забитых в соответствии с утвержденными животных этики протоколов. </li><li> Под микроскопом рассекает, чистые глаза щипцами: избавиться от волос и соединительной ткани, которая крепится к роговицы / склеры границы. Затем перенесите глаза на новое блюдо с ACSF. </li><li> Хотя нежно держа глаз стационарных щипцами зубчатые, использовать угловые микро-рассечение ножницами для удаления глазных мышц. Удалить зрительного нерва, а если он еще привязаны к глазу. Постарайтесь не хлюпать глаз во время этого процесса. Передача глаза на новое блюдо с ACSF. </li><li> Следующая использовать изогнутые микро-рассечение ножницами резать глаз пополам: начинаются в зрительный нерв и прорезать середину роговицы, встреча назад на зрительный нерв, где сокращение было начато. Это идеальное место, если две части глаза являются примерно такими же размерами, потому что это сделает следующий шаг легче. </li><li> Холдинг роговицы с помощью двух пинцетом, осторожно очистите глаза две половины друг от друга. Выньте и выбросьте линзы, внутренних органов и нервной сетчатки глаза от снарядов. Передача снаряды новое блюдо с ACSF. </li><li> Теперь мы готовы выделить ресничного эпителия. Во-первых, ориентироваться глаз оболочку, так что роговица справа от вас и пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) находится на левой. Аккуратно контактный глаз оболочку вниз с прямыми щипцами на стороне ППД. </li><li> Затем с помощью скальпеля, чтобы сократить роговицы и радужной оболочки глаза от ресничного эпителия глаза, осторожно нажимая на скальпель, а не использовать распиловки движений. </li><li> После этого, вырезать реснитчатого эпителия от ППД. Использовать не зубчатые щипцы для передачи полосу реснитчатого эпителия в новый 35-мм блюдо с ACSF. </li><li> Таким же образом, изолировать реснитчатого эпителия из другой оболочки глаза. </li><li> Как только оба ресничного эпителия полосы были собраны, передача полос, на 35-мм блюдо, содержащий 2 мл Dispase. Место блюдо с полосами в 37 ° C инкубаторе в течение 10 минут. </li><li> Через 10 минут, передача полосы от Dispase в чашку, содержащий 2 мл отфильтрованной трипсина, гиалуронидазы и кинуреновой кислоты. Место блюдо при температуре 37 ° С в течение 10 минут. </li><li> Теперь вернемся к рассекает микроскопом. Удерживая склеры вниз с прямыми щипцами, используйте нижнюю часть изогнутой не-зубчатыми щипцами аккуратно очистить реснитчатого эпителия от склеры. </li><li> Удалить из склеры блюдо. Все, что нужно оставить в блюдо теперь клетки интересов и раствора фермента. </li><li> Использование огневой полировкой хлопка подключен пипетки, передачи этого решения в 14-мл трубки. Растирают это решение в 30 раз разбиваются на части эпителиальных клеток, мягко заставляя решение в и из пипетки. </li><li> Центрифуга трубки в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту. При центрифугировании будет сделано, удалить трубку из центрифуги осторожно, поскольку клетки склонны к отрываясь дне пробирки на данном этапе. </li><li> Аккуратно аспирата большинство супернатант использованием огневой полировкой пипетки, а затем добавьте 1 мл ингибитора трипсина в сыворотке свободного СМИ к клеткам. Используйте небольшие скважины хлопка подключен пипеткой измельченного в порошок образца примерно в 50 раз, пока не будет одного-клеточной суспензии. </li><li> Центрифуга трубке снова в течение 5 минут при 1500 оборотов в минуту. </li><li> Удалить супернатант и заменить его на 1 мл ваш покрытие среды. Измельченного в порошок мягко использованием пожарной полированное стекло пипетки для ресуспендирования клеток. </li><li> После графаING клеток, их на пластины требуемой плотности в 24-луночного планшета. Мы обычно пластины 10 клеток / мкл, заполняя каждую лунку первым со средним и последующим добавлением суспензии клеток для получения конечного объема 500 мкл СМИ. </li><li> Место пластины в 37 ° C CO 2 инкубаторе, где она не будет перенесена, пока вы рассчитываете сферах, которые возникают через 7 дней. </li></ol> 3. Результаты выделения стволовых клеток сетчатки <ol><li> Когда эта процедура выполнена успешно, расчлененный цилиарной эпителиальных клеток, должна выглядеть следующим образом после того, как диссоциированных и покрытие при низкой плотности (рис. 1). </li><li> Через 7 дней в культуре, сетчатки стволовыми клетками сферах, которые возникают, подсчитываются. Сфере должно быть более 75 мкм в диаметре и свободно плавающего будет считаться стволовых клеток производных сфере. (Рис. 2). Тем не менее, некоторые клетки будут иметь ограниченный сфероидов распространения и формы, которые не соответствуют критерию размера и не будет считаться стволовых клеток производных сферах; примером такого сфероида показана здесь (рис. 2). </li></ol> 4. Представитель Результаты <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Этот протокол описывает, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз 1-3. Методология выделения полос реснитчатого эпителия может меняться, однако ферменты и методологию для достижения одной клеточной суспензии были оптимизированы в этом протоколе. Важно также, что полосы реснитчатого эпителия, которые были изолированы не содержат большого количества НПП или роговицы, так как эти, как представляется, негативное влияние на общее число сфер, которые могут быть изолированы друг от друга глаз. Кроме того, сыворотки среде, что мы делаем, которая была первоначально разработана для мозга нейросферы 13, идеально подходит для выращивания сетчатки сферах стволовых клеток. Следует также убедиться, что клетки не нарушается после того как они были покрыты и поместили в инкубатор, чтобы растущие сферы не совокупный вместе 14. После сетчатки стволовыми клетками сформировали клональной сферах, их можно пересчитать, чтобы получить перспективные количество стволовых клеток в глазу. Сферы, то может быть отделена в одиночных камерах и пассировать выяснить самообновлению возможности или дифференцировались в различные типы клеток нервной сетчатки и ПЭС, используя различные комбинации факторов роста и / или белков.

<table><tbody><tr><td>Микроскоп Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Источник холодного света</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>двухплечевая оптическая система освещения</td></tr><tr><td>Изогнутые мини-ножницы Ваннаса</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Угловые ножницы Ваннаса</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет Dumont №7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>без насечек</td></tr><tr><td>Пинцет Dumont №5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>прямой</td></tr><tr><td>Прецизионный пинцет</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>изогнутый с насечками</td></tr><tr><td>Рукоятка скальпеля №3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Лезвия скальпеля №10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Стерилизатор с горячими шариками</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Диспаза</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Трипсин</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Гиалуронидаза</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Кинуреновая кислота</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Ингибитор трипсина</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Чашки 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24-луночный планшет</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Пипетки с ватными пробками</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>огнеполированные</td></tr><tr><td>Пробирки 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Полистирол</td></tr><tr><td>Безсывороточная среда</td><td></td><td></td><td>Состав см. Ref# 13</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Гепарин</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Взрослых мышей стволовые клетки сетчатки (РКК) является редким покоя клетка найти в ресничного эпителия (CE) из глаза у млекопитающих 1,2,3. CE состоит из непигментированной внутренних и внешних слоев пигментированные клетки, и клональной РКК колоний, которые вытекают из одного пигментированные клетки от CE состоят как пигментированные и не пигментированные клетки, которые могут быть дифференцированы по форме все типы клеток нервной сетчатки и ПЭС. Существует некоторая полемика о том, все клетки в сферах содержат по крайней мере некоторые пигмента 4, однако клетки все еще ​​способны образовывать различные типы клеток найдены в нейронных сетчатки 1-3. У некоторых видов, например, земноводных и рыб, их глаза способны к регенерации после травмы 5, однако, глаза у млекопитающих не показывает таких регенеративные свойства. Мы стремимся к выявлению стволовых клеток в естественных условиях и понять механизмы, которые держат млекопитающих сетчатки стволовыми клетками покоя 6-8, даже после травмы, а также использовать их как потенциальный источник клеток, чтобы помочь восстановить физические или генетические модели повреждения глаз путем трансплантации 9-12. Здесь мы опишем, как изолировать цилиарной эпителиальные клетки мыши глаз и вырастить их в культуру, чтобы сформировать клональной сетчатки сферах стволовых клеток. С Есть не известные маркеры стволовых клеток в живом организме, эти сферы являются единственным известным способом перспективно выявление населения стволовых клеток в ресничного эпителия глаза.

В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз и вырастить их в культуру в форме клональной сетчатки сферах. Сферах, которые изолированы обладают кардинальные свойства стволовых клеток: самообновлению и multipotentiality.

Ретинальная стволовая клетка (РСК) взрослой мыши представляет собой редкую покоящуюся клетку, которая обнаруживается в цилиарном эпителии (ЦЭ) глаза млекопитающих1,2,3. ЦЭ состоит из...

Общая цель данной процедуры — выделение стволовых клеток сетчатки из цилиарного эпителия глаза. Для этого сначала глаз очищают и разрезают пополам, начиная от зрительного нерва, проводя разрез через роговицу и возвращаясь к зрительному нерву, после чего удаляют нейросенсорную сетчатку и хрусталик. На втором этапе процедуры цилиарный эпителий вырезают путем удаления роговицы, радужки и ретинального пигментного эпителия.Третьим этапом процедуры является ферментативная обработка цилиарного эпителия, удаление склеры и механическая диссоциация эпителия до состояния отдельных клеток. Заключительный этап процедуры заключается в ресуспендировании клеток в безсывороточной среде и их высеве в планшеты для культивирования тканей, содержащие безсывороточную среду с факторами роста. В конечном итоге можно получить результаты, которые позволяют проспективно определить количество стволовых клеток в цилиарном эпителии глаза посредством формирования клональных сфер in vitro.Здравствуйте, меня зовут Бренда Коулз. Наша лаборатория разработала этот метод в ходе изучения работ по регенеративным способностям глаз амфибий и рыб; мы выдвинули гипотезу о том, что в глазу млекопитающих может существовать клетка с аналогичными свойствами. Выделение стволовых клеток сетчатки проводится в специальном стерильном помещении, предназначенном для экспериментов с первичными культурами.Перед началом данной процедуры подготовьте диссекционный микроскоп и источник холодного света, затем разложите стерильные инструменты для диссекции. В каждом боксе имеется стерилизатор горячего воздуха для стерилизации инструментов между этапами работы. Мы выделим стволовые клетки сетчатки из глаз, которые сразу после извлечения из мышей, забитых в соответствии с утвержденными протоколами по этике работы с животными, были помещены в стерильную чашку Петри с искусственной цереброспинальной жидкостью. Самым сложным аспектом данной процедуры является диссекция круглого объекта под микроскопом.Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить исследуемую ткань. Под диссекционным микроскопом очистите глаз с помощью пинцета. Удалите волоски и соединительную ткань, прикрепленную к границе роговицы и склеры. Затем, удерживая глаз зазубренным пинцетом, перенесите его в новую чашку с A CSF.Используйте изогнутые микродиссекционные ножницы, чтобы удалить глазные мышцы. Также удалите зрительный нерв, если он все еще прикреплен к глазу; старайтесь не сдавливать глаз в процессе выполнения этой операции. Перенесите глаза в новую чашку с CSF.Затем с помощью изогнутых микродиссекционных ножниц разрежьте глаз пополам. Начните разрез от зрительного нерва, проведите его через центр роговицы и вернитесь к зрительному нерву, где разрез был начат. Желательно, чтобы две части глаза были примерно равного размера, так как это упростит выполнение следующего этапа.Удерживая роговицы двумя пинцетами, осторожно разделите две половины глаза. Удалите и утилизируйте хрусталики, внутренности глаза и нейросенсорную сетчатку из глазных оболочек. Перенесите оболочки в новую чашку с A CSF.Теперь мы готовы приступить к выделению цилиарного эпителия. Для начала расположите оболочку глаза так, чтобы роговица находилась справа, а ретинальный пигментный эпителий — слева. Аккуратно зафиксируйте оболочку глаза прямым пинцетом со стороны RPE.Затем с помощью скальпеля отделите роговицу и радужку от цилиарного эпителия глаза, осторожно нажимая на скальпель сверху, избегая пилящих движений. После этого отделите цилиарный эпителий от РПЭ. Используйте незубчатые пинцеты, чтобы перенести полоску цилиарного эпителия в новую чашку диаметром 35 миллиметров, содержащую A CSF.Аналогичным образом изолируйте цилиарный эпителий из другой глазной раковины. После сбора полосок цилиарного эпителия перенесите их в чашку диаметром 35 мм, содержащую 2 мл раствора DPBS. Поместите чашку с полосками в инкубатор при температуре 37 °C на 10 минут.Через 10 минут перенесите полоски из пространства для диссекции в чашку, содержащую два миллилитра фильтрованных капель в растворе Халле и kind reic acid. Выдержите чашку при температуре 37 °C в течение 10 минут. Затем снова воспользуйтесь диссекционным микроскопом, прижимая склеру прямым пинцетом.Используйте закругленный конец незубчатого пинцета, чтобы аккуратно отделить цилиарный эпителий от склеры. Извлеките склеру из чашки. В чашке должен остаться только эпителий.Теперь подготовлены интересующие нас клетки и раствор фермента. С помощью пипетки с хлопковой пробкой, оплавленной на огне, перенесите раствор в пробирку объемом 14 л. Тритатуйте данный раствор 30 раз, чтобы разрушить эпителиальные клетки, осторожно пропуская раствор через пипетку туда и обратно, затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 1500 RPM.По окончании центрифугирования осторожно извлеките пробирку из центрифуги, так как клетки могут легко отсоединиться от дна пробирки. На этом этапе аккуратно аспирируйте большую часть SuperNet с помощью огнеполированной пипетки, затем добавьте к клеткам 1 мл ингибитора трипсина в безсывороточной среде.Используйте пипетку с узким отверстием, заткнутую ваткой, чтобы примерно 50 раз перевзвесить образец до получения суспензии из отдельных клеток. Снова центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 1500 RPM, затем удалите супернатант и замените его одним миллилитром среды для посева.Осторожно перемешайте среду, используя огнеполированную стеклянную пипетку, чтобы ресуспендировать клетки. После подсчета клеток высейте их с требуемой плотностью. В 24-луночном планшете мы обычно высеваем 10 клеток на микролитр, сначала наполняя каждую лунку средой, а затем добавляя клеточную суспензию, чтобы получить конечный объем среды 500 микролитров.Поместите планшет в CO₂-инкубатор при 37 °C; планшет не следует перемещать до тех пор, пока не будет проведен подсчет сфер, образующихся через семь дней при успешном выполнении данной процедуры. Диссекированные клетки цилиарного эпителия после диссоциации и посева при низкой плотности должны выглядеть так. Спустя семь дней культивирования подсчитывают образовавшиеся сферы ретинальных стволовых клеток.Сфера должна иметь диаметр более 75 микрон и быть свободно плавающей, чтобы считаться сферой, производной от стволовых клеток. Однако некоторые клетки будут иметь ограниченную пролиферацию и образовывать PHE, которые не соответствуют критерию размера и не будут засчитаны как сферы, производные от стволовых клеток. Пример такого астероида после его развития показан здесь.Этот метод открыл исследователям в области наук о зрении путь к изучению возможности использования стволовых клеток сетчатки при лечении заболеваний сетчатки.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этом видео описывается протокол изоляции чашечки сетчатки без внешних покрывающих слоев от глазного яблока мыши. Извлеченная ткань сетчатки может помочь в изучении различных метаболических путей, происходящих в клетках сетчатки.

Извлечение чашечки сетчатки у мыши: хирургическая процедура для получения неповрежденной чашечки сетчатки из глаза мыши

Это видео демонстрирует процедуру выделения первичных ганглиозных клеток сетчатки мыши (РГК) с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет в будущем изучать РГК с целью лучшего понимания значительного снижения остроты зрения, которое происходит в результате потери функциональных РГК при нейродегенеративных заболеваниях.

Выделение ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

Миллионы людей страдают от дегенеративных заболеваний сетчатки, что приводит к необратимой слепоте. Общим элементом многих из этих заболеваний является потеря ганглиозных клеток сетчатки (RGCs). Этот подробный протокол описывает выделение первичных мышиных РГК положительным и отрицательным выбором с проточной цитометрией.

Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС)-это многофункциональный эпителия глаза. Здесь мы представляем протокол для создания начальных клеточных культур, полученных из мышиных ПЭС.

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

В этом протоколе представлены два метода выделения субклеточных компартментов фоторецепторов мышечных стержней для анализа белка. Первый способ использует живую сетчатку и целлюлозную фильтровальную бумагу для разделения наружных сегментов стержня, в то время как второй использует лиофилизированные сетчатки и клейкую ленту для удаления слоев внутреннего и наружного сегментов стержня.

Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка

Этот протокол описывает метод выделения мышиных постнатальных эндотелиальных клеток сетчатки, оптимизированных для выхода клеток, чистоты и жизнеспособности. Эти клетки подходят для подходов к секвенированию следующего поколения.

Выделение эндотелиальных клеток мышиной сетчатки для секвенирования следующего поколения

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

Первичные культуры глии Мюллера, полученные из сетчатки мышей, представляют собой очень прочный и надежный инструмент для изучения глиального превращения в клетки-предшественники сетчатки после лечения микроРНК. Отдельные молекулы или комбинации могут быть протестированы перед их последующим применением подходов in vivo .

Первичные клеточные культуры для изучения потенциала регенерации мышиной глии Мюллера после лечения микроРНК

Описан простой и эффективный метод выделения клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз молодых пигментированных морских свинок. Эта процедура позволяет проводить последующие молекулярно-биологические исследования изолированного RPE, включая анализ экспрессии генов.

Выделение пигментных эпителиальных клеток сетчатки из глаз морской свинки

В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) действует как важнейший барьер между сосудистой оболочкой и сетчаткой, способствуя здоровью и функции типов клеток сетчатки, таких как фоторецепторы. В данной работе мы описываем простой и эффективный протокол выделения и культивирования взрослых мышей RPE.

Упрощенный метод выделения и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки у взрослых мышей

Узнайте метод выделения стволовых клеток сетчатки из цилиарного эпителия глаза мыши. Этот подход позволяет культивировать клональные сферы для изучения регенеративного потенциала.

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

Больше видео