Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

Общая цель этой процедуры заключается в выделении стволовых клеток сетчатки из цилиарного эпителия глаза. Это достигается путем первичной очистки и разрезания глаза пополам, начиная со зрительного нерва, разрезания роговицы и обратного соединения со зрительным нервом, а затем удаления нервной сетчатки и хрусталика. Вторым этапом процедуры является вырезание цилиарного эпителия путем отсечения радужной оболочки роговицы и пигментного эпителия сетчатки.

Третьим этапом процедуры является ферментативная обработка цилиарного эпителия, удаление склеры и механическая диссоциация эпителия на отдельные клетки. Заключительным этапом процедуры является ресуспендирование клеток в свободной сыворотке среды и помещение их в планшеты для культуры тканей, содержащие свободные сыворотки среды с факторами роста. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые проспективно показывают количество стволовых клеток, обнаруженных в цилиарном эпителии глаза через клональную сферу, образующихся in vitro.

Здравствуйте, меня зовут Бренда Коулз. Наша лаборатория впервые придумала этот метод, когда мы изучали статьи о регенеративных способностях амфибий и рыб в их глазах, и предположили, что, возможно, в глазу млекопитающих есть клетка с такими же способностями. Выделение стволовых клеток сетчатки проводится в специальном стерильном помещении, предназначенном для экспериментов с первичными культурами.

Перед началом этой процедуры установите препарирующий микроскоп и источник холодного света, а затем разложите стерильные инструменты для препарирования. Каждая вытяжка оснащена стерилизатором для стерилизации инструментов между этапами. Мы изолируем стволовые клетки сетчатки из глаз, которые были немедленно помещены в стерильную чашку Петри, содержащую искусственную спинномозговую жидкость После удаления у мышей, принесенных в жертву в соответствии с утвержденными протоколами этики животных, самым сложным аспектом этой процедуры является препарирование круглого объекта под микроскопом.

Необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы не разрушить интересующую ткань Под рассекающим микроскопом очистите глаз щипцами. Избавьтесь от волос и прилегающих к ним тканей, которые прикрепляются к склеральной границе роговицы. Затем перенесите глаз в новую чашку с помощью спинномозговой жидкости, удерживая глаз неподвижно с помощью зубчатых щипцов.

Используйте наклонные микроножницы для удаления глазных мышц. Удалите зрительный нерв, если он все еще прикреплен к глазу, старайтесь не раздавливать глаз во время этого процесса. Перенесите глаза на новую посуду с ликвором.

Далее использовала изогнутые микрорассекающие ножницы, чтобы разрезать глаз пополам. Начните со зрительного нерва и разрежьте середину роговицы, сходясь с тотчас зрительного нерва, где был начат разрез. Идеально, если две части глаза будут примерно одинаковыми по размеру, потому что это облегчит следующий шаг.

Удерживая роговицу с помощью двух щипцов, аккуратно раздвиньте две половинки глаза. Снимите и выбросьте хрусталики, внутренности и нервную сетчатку с оболочек глаз. Переложите ракушки в новую посуду с ликвором.

Теперь мы готовы изолировать ресничный эпителий. Для начала сориентируйте оболочку глаза так, чтобы роговица находилась справа от вас, а пигментный эпителий сетчатки — слева. Аккуратно прикрепите глазную оболочку прямыми щипцами со стороны СИЗОД.

Затем с помощью скальпеля отрежьте роговицу и радужную оболочку от цилиарного эпителия глаза, мягко надавливая на скальпель, а не пилящими движениями. После этого разрежьте цилиарный эпителий подальше от РПЭ. С помощью щипцов без зазубрин перенесите полоску цилиарного эпителия в новую 35-миллиметровую чашку, содержащую ликвор.

Таким же образом изолируйте цилиарный эпителий от оболочки другого глаза. После того, как полоски цилиарного эпителия будут собраны, переложите полоски в 35-миллиметровую посуду, содержащую два миллилитра пространства. Поместите чашку с полосками в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 10 минут.

Через 10 минут переложите полоски из дис-пространства в чашку, содержащую два миллилитра отфильтрованных капель в Галле ур хаазе и добрую рейновую кислоту. Поставьте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут. Теперь вернитесь к препарирующему микроскопу, удерживая склеру прямыми щипцами.

Используйте нижнюю часть кривой щипцами без рейтинга, чтобы аккуратно соскоблить цилиарный эпителий со склеры. Выньте склеры из посуды. Все это следует оставить в блюде.

Теперь есть клетки, представляющие интерес и ферментный раствор. С помощью отполированной огнем ватной пипетки переведите раствор в 14-литровую трубку. Тритрите этот раствор 30 раз, чтобы разрушить эпителиальные клетки, осторожно проталкивая раствор внутрь и из пипетки, центрифугируйте пробирку в течение пяти минут со скоростью 1500 об/мин.

Когда центрифугирование будет завершено, осторожно извлеките пробирку из центрифуги. Так как клетки склонны к отрыву от дна трубки. На этом этапе осторожно отсасывайте большую часть SuperNet с помощью отполированной дозатором с помощью отполированной пипеткой, а затем добавьте в клетки один миллилитр ингибитора трипсина в сыворотке, свободной от сыворотки.

Используйте маленькую ватную пипетку, чтобы попробовать образец примерно 50 раз, пока он не превратится в одноклеточную суспензию. Снова центрифугируйте пробирку в течение пяти минут. При 1500 об/мин удалите надосадочную жидкость и замените ее одним миллилитром гальванического покрытия.

Умеренно охладите с помощью пипетки из полированного огня стекла для ресуспендирования элементов. После подсчета ячеек пластинчатой поверхностью придают им нужную плотность. В 24-луночном планшете мы обычно помещаем 10 клеток на микролитр, сначала заполняя каждую лунку средой, а затем добавляя клеточную суспензию для получения конечного объема в 500 микролитров среды.

Поместите пластину в инкубатор с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, где она не будет перемещаться, пока вы не подсчитаете сферы, которые возникают через семь дней после успешного выполнения этой процедуры. Рассеченные цилиарные эпителиальные клетки должны выглядеть так после диссоциации и нанесения пластин с низкой плотностью. После семи дней в культуре подсчитываются возникающие сферы стволовых клеток сетчатки.

Сфера должна быть более 75 микрон в диаметре и находиться в свободном плавании, чтобы считаться сферой, полученной из стволовых клеток. Тем не менее, некоторые клетки будут иметь ограниченную пролиферацию и образовывать ПГЭ, которые не соответствуют критерию размера и не будут считаться сферами, полученными из стволовых клеток. Пример такого астероида показан здесь После его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области наук о зрении для изучения возможности использования стволовых клеток сетчатки в лечении заболеваний сетчатки.