Name: Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Изучите методы in vitro для анализа взаимодействий клеток Шванна и астроцитов. Эти анализы помогают исследователям понять механизмы регенерации спинного мозга и разработать стратегии клеточной терапии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Уоррен для нее вид помощи.

1. Граница Пробирной: <ol><li> Основные приготовления: Палата слайды покрыты поли-D-лизин в ночное время и стерильные стеклянные пластинки готовятся перед началом эксперимента. Средний которая подготовлена ​​с применением среднего Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), а 1% Пенициллин-Стрептомицин-Fungizon (НПФ). Также бутылку Кальций / Магний свободной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) получают. </li><li> Первичная крысы Шванн клетки культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Первичная культура астроциты крысы трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсин является inactived, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF. </li><li> Трипсинизировали шванновских клеток и астроцитов передаются отдельные 15 мл сокола труб и центрифугировали при 300G в течение 5 минут. </li><li> Шванн клетки и астроциты повторно приостановил при плотности 2 х 10 6 (см. репрезентативные результаты раздел для изменения плотности клеток). </li><li> 50 мкл каплю суспензии клеток Шванн находится на одном конце PDL лунок слайд камеры. Стеклянную пластину был использован для мазка падение к центру камеры для получения прямой край. (Использование стеклорез, прямоугольные покровные стекла разрезаются продольно, так что она будет соответствовать ширине камеры слайдов используется для границы анализы) </li><li> Вторая капля 50 мкл астроцитов подвески была помещена на противоположном конце того же хорошо и смазывают по направлению к центру, чтобы создать линейку параллельно первой мазка падение с небольшой толщиной 0,2 мм зазор между ними. </li><li> Камера слайды содержащие капли помещают в инкубатор при 37 ° С в течение 2 часов. </li><li> Через 2 часа, культуры промывают DMEM удалять не подключенных распада клеток и свежей среде, содержащей DMEM / 10% FCS / 1% PSF добавил. Примечание: DMEM / 10% FCS / 1% PSF может быть дополнена форсколина (2 мкм) и говядине гипофизарный экстракт (BPE) (10 мкг / мл) стимулирует пролиферацию клеток Шванн. BPE будет поставлять факторов роста необходимо, чтобы позволить долгосрочное ячейки Шванн культуры и форсколина поднимает циклический аденозин монофосфат уровней в шванновских клеток индуцировать пролиферацию </li><li> Клетки культивировали в течение примерно 8-10 дней при температуре 37 ° C, 7% СО 2 инкубатора. Среда требует, чтобы менять каждые 3 дня. Два фронта клетка в конце концов достигнет друг с другом и резкую границу образуют между этими двумя типами клеток. На этом этапе эксперименты можно проводить анализ факторов, влияющих на формирование границы. </li><li> Сотрудничество культуры могут быть исправлены с помощью 4% формальдегида и Шванн клетки могут быть immunostained с анти-P75 антител и астроциты с анти-GFAP антител для идентификации клеток в совместной культуре. P75 антитело распознает низких сродство рецепторов NGF на клетки астроциты Шванн которых не хватает. Анти-GFAP антитело распознает глиальных firbrillary кислой белок, который локализуется в цитоплазме астроцитов. (Пожалуйста, см. Рисунок 1A для представителя границе) </li></ol> 2. Миграция Пробирной: <ol><li> 4 луночных планшетах (15 мм скважины) PDL покрытием в ночное время и готовы к созданию астроцитов монослоев. </li><li> Первичная астроцитов культура трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсин является инактивированной, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF и клеточной центрифугировали при 300G в течение 5 минут. (См. рисунок 2) </li><li> Астроциты повторно прерывается в 1х10 5 клеток / мл. 1 мл этого раствора добавляют в каждую лунку, покрытую PDL в 4 и пластин. Астроциты культивируют в течение 24-48 часов, пока монослой полностью вырожденная. </li><li> Для оценки Шванн миграции клеток монослоя на астроциты, параллельно создав астроцитов монослоев, круговая PDL покрытием покровные стекла помещают в 50 мл трубки и раздавил использованием пластиковой пипетки для создания небольших фрагментов стекла. </li><li> Стекло фрагменты переданы в хорошо в 6 хорошо блюдо пластину и с помощью щипцов подходящий размер фрагментов выбраны и размещены в других скважинах. 5 осколки стекла помещают в каждую лунку в 6 и пластин. </li><li> Первичные элементы Шванн культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсинизировали шванновских клеток передаются отдельные 15 мл сокола трубки и центрифугировали при 300 G в течение 5 минут. Шванн клетки ресуспендировали на 2x 10 6 клеток / мл в DMEM/10% FCS / 1% PSF. </li><li> 20 мкл капли суспензии Шванн клеток добавляли в течение каждых 5 покровное фрагменты помещены в 6 хорошо пластин и клетки инкубируют при температуре 37 ° C, 7% CO 2 в течение 2 часов. </li><li> Через 2 часа, Шванн клетки прикрепляются к покровным фрагменты и DMEM/10% FCS / 1% PSF (с добавлением 2 мкм форсколина и 10 мкг / мл BPE добавляется в каждую лунку, так что фрагменты полностью покрыты среды) . </li><li> 6 хорошо чашки, содержащие фрагменты затем помещаются в инкубатор на 24-48 часа, пока осколки стекла, полностью консвободно с клетками Шванн. </li><li> Как только фрагменты сливающийся с клетками Шванн, каждый фрагмент подобран тщательно острыми щипцами и опускают в HBSS, чтобы удалить одинокие клетки, а затем перевернутой лицом вниз на астроциты монослоя. </li><li> Каждая скважина затем покрывается 1 мл DMEM/10% FCS / 1% PSF и Шванн клетки могут мигрировать от 24 до 48 периода. В течение этого периода экспериментального реагентов, таких как факторы роста могут быть добавлены, чтобы оценить их влияние на количество и расстояния миграции клеток Шванн. </li><li> После миграции период, осколки стекла крепятся к нижней части каждой лунки, добавляя 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 минут. После фиксации, immunostain Шванн клеток для p75 (учитывая низкую аффинность рецепторов NGF), то окраска их с помощью АВС-Комплект strepavidin диаминобензидина (DAB), чтобы обеспечить визуализацию шванновских клеток под световым микроскопом. </li></ol> 3. Представитель Результаты: После 8-10 дней Шванн-астроцитов совместно культур показывают резкую границу между этими двумя типами клеток. Эта граница является более выраженным, если форсколина и BPE используется в культуре как Шванн пролиферации клеток усиливается. Если нет границы наблюдается в течение 10 дней, время культура может быть увеличен еще до границы устанавливаются. Изменение соотношения плотности клеток является альтернативным способом увеличения границы формации. Соотношении 3:1 Шванн: астроцитов плотность клеток могут быть использованы при подготовке клеточные суспензии 8,18. После иммуноокрашивания определить Шванн клетки и астроциты, оценить ячейки смешение линии могут быть сделаны где граница устанавливается и количество клеток Шванн мигрирующие в астроциты территории можно пересчитать под флуоресцентным микроскопом. Ниже приведены два примера изображений, полученных границы, одно хорошо сформировавшейся сегрегации шванновских клеток и астроцитов (рис. 1А) и тот, где клетки не отделены хорошо в различных территориях из-за плохой техники (рис. 1В). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> . Рисунок 1 Граница анализа: Шванн-астроцитов взаимодействия. А) 10 день со-культура тест, в присутствии форсколина и BPE, чтобы стимулировать пролиферацию клеток Шванн демонстрирует резкую границу между этими двумя типами клеток (красный = P75, зеленый = GFAP). Б) 10 день со-культуры анализа, где границы не образуется и двух фронтах ячейки смешанные. Это было связано с перемешиванием две капли при размещении астроцитов и Шванн капель ячейки рядом друг с другом во время подготовки границы (красный = P75, зеленый = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Представителю образ сливной астроцитов монослоя Миграция тесты оценки движения одного типа клеток по поверхности другого типа клеток и, следовательно, оценивать различные явления от граничных образования. Практика необходима для обеспечения обращения покровные на монослоев не приводит к повреждению Шванн ячейки покрытые осколками стекла и астроцитов монослоев резким щипцами. Для оценки миграции клеток Шванн, максимальное расстояние миграции и числа мигрирующих клеток от края покровного может быть измерена в световой микроскоп. Ниже представлена ​​картинка шванновских клеток окрашивали антителами P75 использования DAB пятен на поверхности астроцитов монослоя (рис. 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Рисунок 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 3"> Рисунок 3. Миграция методом с использованием перевернутой анализа покровное. ) Шванн клеток (коричневый, immunostained с p75 антитела) мигрируют от края покровного. Стрелка указывает на направление миграции клеток от покровного стекла.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Анализы, описанные выше, были использованы в различных исследований, демонстрирующих роль несколько факторов, влияющих на формирование границы между Шванн-астроциты и ограниченной ячейке Шванн миграции в астроцитарных окружающей среды. Понимание механизмов лежащих в основе этих событий имеет важное значение, поскольку это позволит разработка стратегий для оптимизации и повышения интеграции трансплантатов Шванн клетка после трансплантации и тем самым облегчить выход из аксонов регенерирующим ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Сбалансированный солевой раствор Ханкса (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>ФКС (фетальная телячья сыворотка)</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>ПФС (функция рассеяния точки)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE (Byte Pair Encoding — кодирование пар байтов)</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Форсколин</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Покровные стекла</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Покровные стекла (прямоугольные)</td><td>Менцель-Глейзер</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Предметные стекла с камерой</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>планшеты на 4 лунки, планшеты на 6 лунок</td><td>Nalge Nunc International</td><td></td><td>планшеты на 4 лунки
планшеты на 6 лунок</td></tr><tr><td>антитела к p75 крысы</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>антитело к GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Вторичные антитела (конъюгированные с Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Козий антитело против мыши 568, козий антитело против кролика 488</td></tr><tr><td>Вторичные биотинилированные </td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Козий антимуссный (антитела козы к мыши)</td></tr><tr><td>таблетки DAB </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>набор ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Прецизионный пинцет </td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Параформальдегид</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием in vitro Анализы

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Шванн клетки являются одним из наиболее часто используемых клетками в ремонт стратегии следующие повреждения спинного мозга. Шванн клетки способны поддерживать аксонального регенерации и прорастанию на 1,2 секретирующие фактор роста и оказания содействия росту молекул адгезии 3 и внеклеточной матрицы молекул 4. Кроме того, они myelinate демиелинизированные аксонов в месте повреждения 5. Однако после трансплантации, Шванн клетки не мигрируют с места имплантата и не смешиваются с принимающей астроциты 6,7. Это приводит к образованию резкой границы между клетками Шванн и астроцитов, создавая препятствие для роста аксонов пытается выйти трансплантата обратно в ткани хозяина проксимально и дистально. Астроциты в контакт с клетками Шванн также подвергаются гипертрофии и постоянно регулировать тормозное молекул 8-13. В пробирке тесты были использованы для моделирования Шванн клеточных взаимодействий и астроциты играют важную роль в понимании механизмов, лежащих в основе сотовой поведения. Эти тесты в пробирке включают границы анализа, где со-культуры осуществляется с помощью двух различных клеток каждого типа клеток занимающих разные территории только с небольшой разрыв, отделяющий два фронта клетки. Как клетки делятся и мигрируют, два сотовых фронтах стать ближе друг к другу и, наконец, сталкиваются. Это позволяет поведение двух клеточных популяций, которые будут проанализированы на границе. Другой вариант того же метода является сочетание двух клеточных популяций в культуре и в течение долгого времени два типа клеток выделять с клетками Шванн слипаются вместе, как между островами в астроциты вместе создание нескольких Шванн-астроцитов границ. Второй анализа используются при изучении взаимодействия двух типов клеток является миграция анализа, где сотовая движение можно проследить на поверхности другого типа клеток монослоя 14,15. Этот анализ обычно известен как перевернутая анализа покровное. Шванн клетки культивируют на мельчайшие осколки стекла, и они обращены лицевой стороной вниз на поверхности астроцитов монослоев и миграции оценивается от края покровного. И анализы играют важную роль в изучении основных механизмов, участвующих в клеточном изоляции и границы образования. Некоторые из молекул определяется с помощью этих методов включают N-Кадгерины 15, хондроитин сульфат протеогликаны (CSPGs) 16,17, FGF / Гепарин 18, Еф / Ephrins 19. В этой статье намерен описать анализа границ и миграции в анализе поэтапно и выяснить возможные технические проблемы, которые могут возникнуть.

В этой статье намерен описать поэтапно часто используемых<em&gt; В пробирке</em&gt; Тесты, используемые при изучении Шванн клеточной asrtocyte взаимодействий.

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Клетки Шванна являются одними из наиболее часто используемых клеток в стратегиях восстановления после повреждений спинного мозга. Клетки Шванна способны поддерживать аксональный...

Клетки Шванна представляют собой глиальные клетки периферической нервной системы, которые применяются для восстановления при повреждениях спинного мозга. В основном они вырабатывают факторы роста, которые поддерживают регенерацию аксонов, а также обеспечивают адгезию, способствующую росту, и молекулы внеклеточного матрикса. Кроме того, они миелинизируют аксоны в месте повреждения.К сожалению, трансплантированные swan-клетки не мигрируют из места имплантации и не смешиваются с астроцитами реципиента. Это приводит к формированию четкой границы и препятствует интеграции растущих аксонов в ткань хозяина. В данном видео используются два метода для изучения взаимодействия swan-клеток и астроцитов in vitro.Сначала демонстрируется граничный анализ, при котором на предметном стекле создаются и культивируются зоны лебединых клеток и астроцитов. Затем на стекло добавляют различные реагенты с последующим дополнительным культивированием. После этого проводится визуализация и анализ предметных стекол для определения влияния реагентов на миграцию лебединых клеток в зону астроцитов или наоборот.Далее демонстрируется анализ миграции, при котором фрагменты покровного стекла с гнездами шванновских клеток переворачивают на монослои астроцитов. Снова в культуральную среду добавляют различные реагенты, после чего проводят визуализацию культуры для оценки степени и расстояния миграции шванновских клеток по монослоям астроцитов. В конечном счете, данный тип анализа должен способствовать разработке стратегий по оптимизации и улучшению интеграции трансплантатов шванновских клеток после пересадки.Преимущество этих анализов in vitro перед существующими методами, при которых оценивается миграция на чистых субстратах, заключается в том, что они более релевантны анализам in vivo, где трансплантированные клетки вступают в контакт с астроцитами. Кроме того, данные анализы in vitro могут быть использованы в других областях, таких как клеточная биология, для решения ключевых вопросов, например, инвазии и миграции опухолевых клеток. Перед началом анализа подготовьте следующие материалы: камерные предметные стекла, покрытые поли-D-лизином, стерильные предметные стекла, среду для культивирования клеток и флакон с кальцием.Для приготовления исходного раствора сбалансированной соли Хэнкса без магния сначала обработайте первичные клетки Шванна крысы трипсином в течение трех минут, а первичные астроциты крысы — в течение пяти минут. После того как клетки открепятся, инактивируйте трипсин, добавив культуральную среду. Затем перенесите клетки Шванна и астроциты в отдельные пробирки Falcon объемом 15 мл и центрифугируйте их при 300 ×g в течение пяти минут.Тем временем с помощью стеклореза разрежьте прямоугольные покровные стекла вдоль так, чтобы они соответствовали ширине камерных предметных стекол, используемых для анализа границ, и облегчали растекание капли клеточной суспензии. После центрифугирующего ресуспендирования доведите концентрацию шванновских клеток и астроцитов до 2 × 10⁶ клеток/мл. На одном конце камерного предметного стекла, покрытого полилизином, аккуратно поместите одну каплю суспензии шванновских клеток объемом 50 µL.С помощью стеклянной пластинки размажьте каплю по направлению к центру камеры, чтобы сформировать ровный край. Затем поместите вторую каплю суспензии астроцитов объемом 50 µL на противоположный край этой же лунки и размажьте ее по направлению к центру. Чтобы создать прямой край, параллельный первому, между ними должен остаться зазор 0,2 mm.Поместите камеру-слайд с каплями в инкубатор при 37 °C на два часа. Через два часа промойте культуры DMEM, чтобы удалить все неадгезивные клеточные остатки.Для стимуляции пролиферации шванновских клеток добавьте среду в камерные предметные стекла. Данная среда дополнена форсколином и экстрактом говяжьего гипофиза. Форсколин повышает уровень циклического АМФ в шванновских клетках для индукции пролиферации, а экстракт говяжьего гипофиза обеспечивает факторы роста, необходимые для длительного культивирования.Инкубируйте предметное стекло от 8 до 10 дней. Два клеточных фронта в конечном итоге достигнут друг друга, и между двумя типами клеток сформируется четкая граница. На этом этапе можно приступать к проведению экспериментов.Для анализа факторов, участвующих в формировании границы, и исследования этой границы зафиксируйте совместную культуру 4% формальдегидом. Чтобы дифференцировать шванновские клетки и астроциты, проведите иммуноокрашивание с использованием антител к P75 и GFAP соответственно. Антитела к P75 распознают низкоаффинный рецептор NGF на шванновских клетках, который отсутствует у астроцитов; антитела к GFAP распознают глиальный фибриллярный кислый белок, локализованный в астроцитах. Для проведения анализа миграции.Приступите к посеву клеток. В каждую лунку 4-луночного планшета с диаметром лунок 15 мм внесите 1 × 10⁵ астроцитов в 1 мл среды. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 24–48 часов до достижения полного слияния монослоя.Тем временем, чтобы подготовить клетки лебедя для оценки миграции на монослоях астроцитов, поместите круглые стеклянные покровные стекла, покрытые полилизином, в пробирку объемом 50 мл и раздавите их пластиковой пипеткой, создавая мелкие фрагменты стекла. Перенесите фрагменты стекла в одну лунку шестилуночного планшета с помощью пинцета. Выберите фрагменты размером примерно 5 мм и перенесите по пять таких фрагментов в каждую из остальных лунок.Обработайте клетки Шванна трипсином I в течение трех минут. Затем перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте их при 300 ×g в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки Шванна в культуральной среде до концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл.Затем добавьте по 20 µL суспензии шванновских клеток на каждый фрагмент и инкубируйте при 37 °C и 7% CO2 в течение двух часов. По истечении двух часов извлеките шванновские клетки из инкубатора. В каждую лунку добавьте достаточное количество культуральной среды, дополненной 2 µM Scale-in и 10 µg/mL BPE.Таким образом, фрагменты с прикрепленными клетками полностью покрывают средой и инкубируют в течение 24–48 часов, пока стеклянные фрагменты полностью не заселятся клетками Schwann. Как только фрагменты будут заселены клетками Schwann, извлеките из инкубатора как клетки Schwann, так и астроциты. С помощью пинцета осторожно извлеките каждый фрагмент с прикрепленными клетками Schwann.Погрузите фрагмент в HBSS, чтобы удалить неприкрепившиеся клетки, затем переверните его лицевой стороной вниз на монослой астроцитов. После переноса всех фрагментов добавьте по 1 mL культуральной среды в каждую лунку.Если планируется оценка воздействия экспериментальных реагентов, таких как факторы роста, их следует добавить в среду. Верните планшет в инкубатор и оставьте клетки Швана мигрировать на 24–48 часов в течение периода миграции. После завершения миграции зафиксируйте стеклянные фрагменты на дне каждой лунки, добавив 4% параформальдегид на 30 минут.Проведите иммуноокрашивание шванновских клеток на P 75, затем окрасьте их с помощью набора ABC Strept ADIN с использованием DIAM-бензадина для визуализации шванновских клеток под световым микроскопом через 10 дней. Ко-культура шванновских клеток и астроцитов демонстрирует четкую границу между двумя типами клеток. Здесь шванновские клетки идентифицированы по P 75.Окрашивание рецептора NGF с низким аффинитетом показано красным цветом, а астроциты идентифицированы по окрашиванию GFAP, показанному зеленым цветом. Граница между этими клетками становится более выраженной при использовании форсколина и BPE в культуре, так как это усиливает пролиферацию шванновских клеток. Напротив, в данном анализе совместного культивирования в течение 10 дней клетки не разделились четко по разным территориям.Это было обусловлено плохой техникой и смешиванием двух типов клеток. В то время как при подготовке анализа границы, анализы миграции оценивают перемещение одного типа клеток по поверхности другого типа клеток и, следовательно, оценивают явление, отличное от формирования границы. На этом изображении показаны клетки лебедя (swan cells), мигрирующие от края покровного стекла; стрелка указывает направление миграции клеток.При проведении этих анализов in vitro важно помнить, что воздействие реагентов может быть направлено как на астроциты, так и на шванновские клетки, и поэтому требуются последующие эксперименты, чтобы точно определить, какой тип клеток ответственен за наблюдаемое усиление или ослабление миграции. Кроме того, можно использовать другие методы, такие как иммунохимический анализ, особенно при анализе границы, чтобы показать, какие молекулы подвергаются ап- или даун-регуляции на границе между шванновскими клетками и астроцитами.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этой статье описывается новый протокол и набор реагентов предназначен для чувствительной измерения нейротоксического действия соединений и процедур о сотрудничестве культур нейронов и астроцитов с использованием высоких контент-анализ. Результаты показывают, что высокие контент-анализ представляет захватывающий роман технологии для нейротоксичности оценки.

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.

Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Здесь мы опишем Шванновских клеток (СК) миграции тест, в котором SCs могут развиваться расширения аксонов.

Анализируя мышиной сотовых шванновских развития по Растущие аксоны

Фенотипически дикие астроциты и нейральные стволовые клетки, собранные у мышей, сконструированных с помощью флоксированных, условных онкогенных аллелей и преобразованных с помощью вирусной Cre-опосредованной рекомбинации, могут быть использованы для моделирования патогенеза астроцитомы in vitro и in vivo путем ортотопической инъекции трансформированных клеток в мозг сингенных, иммунокомпетентных однопометников.

Моделирование Астроцитома Патогенез In Vitro И В Vivo Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Этот протокол описывает косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования для анализа на секции нейрон-глиальных взаимодействий.

Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:<em&gt; In Vitro</em&gt; Настройка для детального исследования Нейрон-глии взаимодействий

Поддержание охвата кроветворного мозга является ключевым фактором гомеостаза центральной нервной системы. Этот протокол описывает методы in vitro для определения фундаментальных и патологических процессов, которые модулируют покрытие гематоэнцефалического барьера.

В анализах in vitro для оценки образования и разрушения сосудов типа мозгового барьера

Протокол AWESAM, описанный здесь является оптимальным для культивирования мышиных астроциты в отрыве от других клеток головного мозга в быстрый, простой и недорогой способ. Астроциты AWESAM выставку спонтанное Ca2 + сигнализации, морфология и ген выражение профили аналогичны астроциты в естественных условиях.

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

Здесь мы представляем протоколы для расследования ухудшение нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях. Мы конкретно рассмотреть способы определения проницаемости гематоэнцефалического барьера и gelatinase деятельности в лейкоцитарной миграции через глиальная мембрана.

Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях

Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.

Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах

Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.

Создание смешанных культур нейрональных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета

В этой статье мы подробно описываем методологию выделения сетчатки от глаза мыши для расширенных экспериментов ex vivo . Этот протокол подчеркивает, что этот технически сложный подход становится доступным для исследователей, которые хотели бы воспользоваться возможностями исследований, предоставляемыми сохранением глии сетчатки in situ в живых тканях.

Эксплантная модель ex vivo для изучения глиальных взаимодействий в сетчатке мыши

Изучите методы in vitro для анализа взаимодействий клеток Шванна и астроцитов. Эти анализы помогают исследователям понять механизмы регенерации спинного мозга и разработать стратегии клеточной терапии.

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Больше видео