Поддержание Wolbachia в бесклеточных среднего

Меня зовут Кортни Стоун. Я работаю в Школе общественного здравоохранения Блумберга при Университете Джонса Хопкинса в лаборатории доктора Джейсона Раскона. Сегодня мы проведем очистку бактерий из культуры клеток насекомых.

На самом деле это очень простая процедура. Мы начинаем со сбора клеток, затем физически разрушаем мембраны эукариотических клеток-хозяев с помощью лизиса стеклянными шариками. После этого мы используем дифференциальное центрифугирование, чтобы отделить бактерии от клеточного дебриса хозяина.

Затем мы используем серию этапов фильтрации для дальнейшего удаления частиц клеток хозяина, чтобы в итоге получить только очищенный бактериальный осадок. Это одно из основных требований. Перед нами ламинарный шкаф для культивирования клеток; он используется для поддержания стерильности, так как клеточные культуры очень легко контаминировать.

Нам также понадобятся среды для культивирования клеток, сами клетки, которые мы выращиваем в пластиковых флаконах. Кроме того, потребуются стеклянные шарики диаметром 3 мм, конические пробирки объемом 50 мл и центрифуга, способная осуществлять высокоскоростное центрифугирование (примерно 18 000 G) для осаждения бактерий, а также центрифугирование при 3000 G или 2 500 G для осаждения клеток-хозяев. Первым делом мы начнем с наших культивируемых клеток.

Они выращены, верно? Это флаконы T 75. В них содержится 15 mls культуральной среды, а также наши образцы.

Первым делом мы приступим к разрушению клеточного слоя и сбору клеток в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Вам нужно совершать движения вверх-вниз по клеточному слою, чтобы переместить все клетки в среду. После того как клетки окажутся в среде, мы просто перенесем их пипеткой в коническую пробирку объемом 50 мл.

Теперь в две суспензии клеток мы добавим стеклянные шарики диаметром 3 мм. Они были автоклавированы и могут быть использованы повторно. Перед повторным использованием их можно промыть, замочить в растворе отбеливателя, а затем снова автоклавировать.

Аккуратно перелейте содержимое, стараясь не касаться горлышком стеклянного флакона B горлышка центрифужной пробирки. В каждую центрифужную пробирку поместите стеклянные шарики объемом примерно до отметки 5 мл. Далее необходимо физически разрушить клетки кишечника, чтобы высвободить бактерии в суспензию.

Затем мы используем вортекс, установив его на максимальную скорость, и перемешиваем пробу в течение пяти минут. Таким образом, мы подвергаем клетки вортексированию с использованием стеклянных шариков диаметром 3 мм в течение пяти минут, после чего отбираем супернатант чистой пипеткой в чистую стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Мы получим полученную суспензию, которая состоит из высвобожденных бактерий и раствора, а также из клеточного дебриса.

Следующим этапом будет центрифугирование на низкой скорости, чтобы осадить весь лишний материал и оставить бактерии в суспензии. Для этого мы будем использовать центрифугу при 2,500 ×g в течение 10 минут. Центрифугирование будет проводиться при температуре 4 °C, чтобы облегчить сбор осадка на дне.

Затем мы помещаем пробирку в центрифугу, проверяем балансировку, закрываем крышку и центрифугируем в течение 10 минут. Теперь я центрифугировал супернатант, содержащий клеточный дебрис хозяина, а также очищенные бактерии. Центрифугирование проводилось при 2 500 G в течение 10 минут.

Как вы можете видеть, на дне моей пробирки образовался осадок, состоящий из клеточного дебриса. Мои недавно высвобожденные бактерии все еще находятся в супернатанте, так как центрифугирования было недостаточно для их осаждения. Следующим шагом я удалю супернатант и профильтрую его через фильтр с размером пор 5 µm.

Перед нами фильтр с размером пор 5 мкм, который подходит к любому типу шприцев. Сейчас я буду использовать шприц объемом 30 мл; просто потяните поршень вверх, а затем, не касаясь самого фильтра (особенно его нижней части, которая должна оставаться стерильной), присоедините шприц к фильтру, просто прикрутив его. Затем осторожно нажмите на поршень, чтобы пропустить супернатант через фильтр в пробирку.

Не следует нажимать слишком сильно, так как можно повредить фильтр, и он перестанет работать. Если возникнет необходимость прикладывать значительное усилие, фильтр следует снять и заменить, поскольку это означает, что он сильно забился клеточным дебрисом. На этом этапе, в зависимости от объема, в качестве дополнительного метода получения очень чистой бактериальной культуры, мы добавляем в центрифужную пробирку для высокоскоростного центрифугирования раствор сахарозы 250 mM, прошедший фильтрационную стерилизацию.

Заполните флакон по крайней мере на 80%. Обычно мы наполняем его до самого горлышка. Пробирки должны быть заполнены таким образом, чтобы они не имплодировали внутри нашей высокоскоростной центрифуги.

Теперь мы центрифугируем супернатант для осаждения очищенных бактерий при 18 000 ×g в этой высокоскоростной центрифуге. Разумеется, мы следим за тем, чтобы пробирки были сбалансированы, после чего закрываем крышку. Установим время центрифугирования на 10 минут.

Эту процедуру рекомендуется проводить при температуре 10 °C или ниже; соответствующая настройка температуры указана здесь. Угловая скорость для данного конкретного ротора центрифуги составляет 12,5 оборотов в минуту. Согласно таблице пересчета, скорость центрифугирования составит примерно 18 670 ×g. Таким образом, мы провели высокоскоростное центрифугирование для осаждения очищенных бактерий.

Теперь, как вы видите, на дне центрифужной пробирки образовался плотный бактериальный осадок. Теперь мы удалим весь супернатант в контейнер для жидких отходов. На данном этапе нам необходимо ресуспендировать бактерии.

Я ресуспендирую осадок в двух миллилитрах нашей культуральной среды — среды Шнайдера для насекомых, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой. Я просто ресуспендирую осадок, перенося жидкость пипеткой вверх и вниз до тех пор, пока все бактерии снова не перейдут в раствор. Теперь, когда бактерии снова находятся в суспензии, мы проведем еще один этап очистки, чтобы избавиться от возможных остатков клеток хозяина.

Для этой процедуры мы будем использовать фильтр с порами 2,7 мкм. Я предпочитаю использовать пластиковый корпус от нашего фильтра с порами 5 мкм в качестве держателя. Таким образом, мы набираем раствор, прикручиваем шприц к фильтру 2,7 мкм и фильтруем жидкость в пробирку для длительного хранения.

Как и в случае с предыдущим фильтром, аккуратно нажмите на поршень. Теперь у нас есть раствор очищенных бактерий. Далее я покажу вам, как проводится анализ жизнеспособности.

Мы используем набор для определения жизнеспособности бактерий Backlight Live/Dead от компании Molecular Probes. Этот набор включает два красителя: пропидий иодид и Cyto9. Пропидий иодид обладает красной флуоресценцией и окрашивает только те бактерии, бактериальная мембрана которых полностью не повреждена, а Cyto9 окрашивает все бактерии.

Таким образом, при рассмотрении этих бактерий под микроскопом, оснащенным флуоресцентной оптикой, все бактерии будут флуоресцировать зеленым цветом, а отдельная группа — погибшие бактерии — будет флуоресцировать красным. Мы берем небольшую аликвоту нашего очищенного образца; в данном случае я возьму всего 10 µL, этого достаточно для приготовления одного предметного стекла. Затем я распределю её по двум другим.

Затем я добавлю два других красителя: всего 1 µL смеси пропидиййодида и Cyto 9 в нашу бактериальную суспензию. После этого образец можно инкубировать в темноте в течение 15 минут. Однако мы обнаружили, что препарат можно монтировать и анализировать практически сразу, чтобы увидеть результаты.

Теперь я приступлю к микроскопическому исследованию моего препарата с бактериями, окрашенными красителем для определения живых и мертвых клеток. Нанесем краситель на предметное стекло, накроем его покровным стеклом и приступим к наблюдению. Я буду использовать комбинированный красный/зеленый фильтр, чтобы оценить жизнеспособность моих бактерий.

Итак, когда я открываю затвор, я вижу свои бактерии, они выглядят примерно как крошечные точки. При этом я вижу, что примерно 90–95% бактерий окрашены в зеленый цвет, в то время как только около 5%, я бы сказал, в красный. Таким образом, у нас очень высокий показатель жизнеспособности, верно?

Итак, я только что ознакомил вас с процедурой очистки жизнеспособных Akia из культивируемых клеток насекомых. Данный протокол включал физическое разрушение эукариотических клеток-хозяев с последующим дифференциальным центрифугированием для выделения очищенных бактерий, а также серию этапов фильтрации для обеспечения качества очищенных бактерий и их полного отделения от всех компонентов клеток-хозяев. Затем мы рассмотрели анализ живых и мертвых клеток с помощью флуоресценции, в котором используются два красителя для оценки жизнеспособности ваших бактерий.

Теперь вы можете использовать очищенные бактерии в различных целях, включая инфицирование других систем культивируемых клеток для повышения эффективности заражения конкретной системы. Также вы можете проводить метаболические исследования или любые другие исследования, используя ваши живые очищенные бактерии.