Питатель-Free адаптации, культуры и пассажи клеток человека IPS использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Следующий протокол предусматривает обучение для адаптации человека индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) Клетки для фидерных без культуры с помощью полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды (КСР-FF). Как только адаптированные, инструкции для постоянного обслуживания также обеспечены.

Общая цель этой процедуры заключается в адаптации и поддержании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека к культуре без фидера с использованием полной замены сыворотки с нокаутом, свободной от питательной среды. Это достигается путем предварительной подготовки пластин с гелевым покрытием, покрытием TRX или пластинами с покрытием Cell Start. Вторым этапом процедуры является передача IPS от MEF к питательной среде, свободной от подачи, с использованием дискового пространства.

Заключительным этапом процедуры является постоянное поддержание чистоты питателя IPS-ячеек. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают аналогичный рост клеток и стволовость, обнаруженные в культурах метамфетамина, путем иммуноокрашивания плюрипотентными маркерами. Привет, меня зовут Кейт Вагнер, я работаю на сайте GIB в компании Life Technologies.

Основное преимущество этой методики перед существующими заключается в том, что вы можете сэкономить время и повысить консистенцию клеточной культуры при использовании замены нокаутирующей сыворотки на протяжении всего рабочего процесса. На сегодняшний день семейство нокаутных продуктов включает в себя полный список сред и реагентов для фидерных, бесфидерных и бесксеноэкстраксионных условий для эмбриональных стволовых клеток человека, эмбриональных стволовых клеток мыши и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. KSR может быть использован для выращивания деривации, расширения, криоконсервации и начальных этапов дифференциации.

В этом видео вы узнаете, как адаптировать и упаковывать клетки с использованием KSR в условиях отсутствия кормушек. Посуды для культур, покрытых гелем TRX, необходимы для адаптации и упаковки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в условиях отсутствия кормителей за день до приготовления этих покрытых покрытием блюд, медленно разморозьте одну тубу геля TRX, оставив ее в холодильнике на ночь, на следующий день разбавьте тубу размороженного геля TRX от одного до 100 в базальной среде, переложив один миллилитр геля Rex в бутылку, содержащую 99 миллилитров базального Терпимая. Аккуратно перемешайте раствор.

Мы рекомендуем использовать нокаут D-M-E-M-F 12 в качестве базальной среды, но для других вариантов см. Текст протокола. Покройте всю поверхность каждой чашки для культуры раствором геля Rex. На каждую 60-миллиметровую посуду добавьте по 1,5 миллилитров раствора гелевого трека.

Выдерживайте посуду в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Дополнительные тарелки можно завернуть в парфюм и хранить в холодильнике до четырех недель. Дополнительно разбавленный гель TRX можно выделять и хранить при температуре от минус 20 до минус 80 градусов Цельсия, но перед использованием следует избегать многократных циклов замораживания и оттаивания.

Переложите посуду с покрытием из геля TRX в лимонную или проточную вытяжку и дайте ей сбалансироваться до комнатной температуры. Кроме того, подготовьте все остальные необходимые реагенты и убедитесь, что все среды сбалансированы до 37 градусов Цельсия и соответствующим образом газообразны. Адаптировать ПИПК человека к питательной среде без первой культуры.

IPSC находится на клетках, питающих метамфетамин до тех пор, пока они не станут слитыми на 70-80%. Отсасывайте среду из каждой 60-миллиметровой посуды для культуры и добавляйте соответствующее количество раствора диспа, которое составляет один миллилитр. В этом случае инкубируйте посуду при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут.

Отсадите раствор диспа из каждой чашки для культивирования и осторожно промойте клетки, питающиеся метамфетамином, с помощью DPBS два-три раза. Затем добавьте соответствующее количество полной среды для замены сыворотки в каждую чашку для культур. С помощью скребка для ячеек аккуратно соскребите ячейки с поверхности посуды.

Соберите клеточную суспензию из каждой посуды в отдельные 15 миллилитровые конические трубки. Промойте каждую чашку для культивирования соответствующим количеством полной заменительной среды для сыворотки и добавьте промывочную среду в конические пробирки объемом 15 миллилитров, содержащие центрифугу для клеточной суспензии. 15 миллилитровые конические трубки при температуре 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре для гранулирования клеток.

После центрифугирования тщательно отаскайте и выбросьте супернат, не нарушая клеточную гранулу. Осторожно переверните трубку, чтобы полностью выбить клеточную гранулу со дна пробирки. Добавьте соответствующее количество полной замены сыворотки, подайте питательную среду без питательной среды в соответствии с желаемым соотношением разделения.

И аккуратно суспензируйте гранулу. Не разбивайте комки клеток на меньший размер, потому что меньшие комки плохо прилипают к поверхности. Отсадите любой остаточный раствор геля TRE из ранее приготовленных культуральных чашек, покрытых гелем Rex, и медленно добавьте соответствующее количество клеточной суспензии в каждую чашку для культивирования.

Переместите чашку для культивирования вперед и назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы рассеять клетки по поверхности чашки. Аккуратно поместите чашки для культур в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с увлажненной атмосферой от четырех до 6% CO2 в погрешности воздуха. После этого ежедневно заменяйте отработанную среду до тех пор, пока клетки не станут примерно на 70-80% сливающимися.

Когда индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки выращивают полную замену сыворотке, свободная питательная среда на 70-80% сливаются, они готовы к субкультуре. Если есть какие-либо дифференцированные клетки, удалите их перед упаковкой. Отсадите отработанную среду из 60-миллиметровой чашки для культивирования с помощью пипетки и дважды промойте клетки.

С помощью DPBS аккуратно добавьте один миллилитр предварительно подогретого дискового раствора в чашку для культивирования. Поворачивайте чашку для культивирования, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут.

Затем аспирируйте раствор dis space и дважды аккуратно промойте клетки DPBS, добавьте полную замену сыворотки, питательную среду без питательной среды и аккуратно соскребите клетки с поверхности чашки для культивирования. С помощью скребка для клеток переложите клетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте чашку для культуры дважды с полной заменой сыворотки.

Питатель не содержит среды, аккуратно распыляя все ячейки, которые не отделились. Вытяните среду из обоих полосканий с ячейками в 15 миллилитровую трубку. Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки, не повреждая клеточную гранулу.

Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно переверните трубку, чтобы полностью выбить клеточную гранулу со дна пробирки. Аккуратно ресуспендируйте клетки для полного замещения сыворотки.

Подавайте свободную среду с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки. Не оценивайте трижды. Переложите ячейки в свежую 60-миллиметровую форму, покрытую гелем TRX в желаемом соотношении.

Переместите чашку для культуры вперед и назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы рассеять клетки по ее поверхности. Поместите чашку для культуры в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с увлажненной атмосферой от четырех до 6% углекислого газа в воздухе на следующий день. Аккуратно замените отработанную среду с полной заменой сыворотки.

Подача свободной среды для удаления клеточного мусора. В дальнейшем заменяйте использованный носитель каждый день. На этом изображении фазового контраста показаны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, выращенные на чашках для культур, покрытых гелевым покрытием TRX, с использованием полной замены сыворотки, не содержащей питательной среды.

Морфология ПЛИК, аналогичная человеческим эмбриональным стволовым клеткам, характеризующаяся большими ядрами и скудным окрашиванием цитоплазменных иммунов, показывает, что культивируемая МПК с нокаутирующей заменительной средой сыворотки и коктейлем фактора роста экспрессировала плюрипотентные маркеры, OCT 4 и SSEA 4. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как адаптировать и поддерживать замену IPC и нокаут-сыворотки без питательных веществ. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.