Питатель-Free адаптации, культуры и пассажи клеток человека IPS использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Общая цель данной процедуры заключается в адаптации и поддержании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в бесфидерной культуре с использованием бесфидерной среды, содержащей комплексный заменитель сыворотки knockout. Это достигается путем предварительной подготовки планшетов с покрытием из gelt, TRX или cell start. Вторым этапом процедуры является пассаж ИПСК с МЭФ в бесфидерную среду с использованием метода дискретного переноса.

Заключительным этапом процедуры является постоянное поддержание культур ИПС-клеток в бессывороточных условиях (без использования фидерного слоя). В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие рост клеток и степень плюрипотентности, аналогичные тем, что наблюдаются в культурах с использованием МЕС, что подтверждается иммуноокрашиванием на маркеры плюрипотентности. Здравствуйте, я Кейт Вагнер из подразделения GIB компании Life Technologies.

Основным преимуществом данного метода перед существующими техниками является возможность экономии времени и повышения воспроизводимости результатов культивирования клеток при использовании заменителя сыворотки Knockout на всех этапах рабочего процесса. На сегодняшний день семейство продуктов Knockout включает полный перечень сред и реагентов для условий с использованием фидерных слоев, безфидерных и ксено-свободных условий для эмбриональных стволовых клеток человека, эмбриональных стволовых клеток мыши и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. KSR может применяться для получения, поддержания роста, экспансии, криоконсервации, а также на начальных этапах дифференцировки.

В следующем видео будет продемонстрировано процесс адаптации и пассирования ваших клеток с использованием KSR в бесфидерных условиях. Для адаптации и пассирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в бесфидерных условиях требуются чашки для культивирования с покрытием из GelTRAC. За день до подготовки таких чашек медленно разморозьте одну пробирку GelTRAC, оставив ее в холодильнике на ночь. На следующий день разведите размороженный GelTRAC в базальной среде в пропорции 1:100, перенеся 1 mL GelTRAC в флакон, содержащий 99 mL базальной среды. Аккуратно перемешайте раствор.

Мы рекомендуем использовать KnockOut DMEM/F-12 в качестве базальной среды, однако другие варианты указаны в тексте протокола. Полностью покройте поверхность каждой культуральной чашки раствором Geltrex. Для каждой чашки диаметром 60 мм добавьте 1,5 мл раствора Geltrex.

Инкубируйте чашки в течение одного часа при 37 °C. Дополнительные планшеты можно обернуть парафильмом и хранить в холодильнике до четырех недель. Дополнительный разведенный gelt TRX можно разлить по аликвотам и хранить при температуре от -20 до -80 °C, однако перед использованием следует избегать многократных циклов замораживания-оттаивания.

Перенесите чашки с покрытием Gelt TRX в ламинарный шкаф и дайте им equilibrated до комнатной температуры. Кроме того, подготовьте все остальные необходимые реагенты и убедитесь, что все среды прогреты до 37 °C и надлежащим образом газированы. Для адаптации человеческих IPC к бесфидерной среде первой культуры.

iPSC культивируют на фидерных клетках до достижения ими 70–80% конфлюэнтности. Аспирируют среду из каждой чашки для культивирования диаметром 60 мм и добавляют соответствующее количество раствора Dispa, что составляет 1 мл. В данном случае чашки инкубируют при 37 °C в течение трех-пяти минут.

Отоснимите раствор диспа с каждой культуральной чашки и осторожно промойте клетки-фидеры мыши путем дву- или трехкратного добавления DPBS. Затем добавьте в каждую чашку соответствующий объем полной среды для замены сыворотки. С помощью скребка для клеток осторожно снимите клетки с поверхности чашки.

Соберите суспензию клеток из каждой чашки в отдельные конические пробирки объемом 15 мл. Промойте каждую культуральную чашку подходящим количеством полной среды с заменителем сыворотки и добавьте промывочную среду в конические пробирки объемом 15 мл с клеточной суспензией. Центрифугируйте конические пробирки объемом 15 мл при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре для осаждения клеток.

После центрифугирования осторожно аспирируйте и удалите супернатант, стараясь не задеть осадок клеток. Аккуратно встряхните пробирку, чтобы полностью отделить осадок клеток от дна. Добавьте соответствующий объем среды с полной заменой сыворотки и без фидерного слоя в соответствии с выбранным коэффициентом пересева.

Затем осторожно ресуспендируйте осадок. Не измельчайте клеточные агрегаты, так как более мелкие скопления плохо прикрепляются к поверхности. Аспирируйте остатки раствора геля TRE из предварительно подготовленных культуральных чашек, покрытых гелем Rex, и медленно добавьте соответствующий объем клеточной суспензии в каждую чашку.

Несколько раз осторожно перемещайте чашку с культурой вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности чашки. Осторожно поместите чашки с культурами в инкубатор при 37 °C с увлажненной атмосферой, содержащей от 4 до 6% CO2 в воздухе. В дальнейшем ежедневно заменяйте отработанную среду до тех пор, пока клетки не достигнут примерно 70–80% конфлюэнтности.

Когда индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, выращиваемые в безсывороточной среде без использования фидерного слоя, достигают конфлюэнтности 70–80%, они готовы к субкультивированию. Если присутствуют дифференцированные клетки, удалите их перед пассированием. Аспирируйте отработанную среду из культуральной чашки диаметром 60 мм с помощью пипетки и дважды промойте клетки.

С помощью DPBS осторожно добавьте один миллилитр предварительно нагретого раствора на основе дисков в чашку с культурой. Повращайте чашку с культурой, чтобы покрыть всю поверхность клеток. Инкубируйте культуру при 37 °C в течение трех-пяти минут.

Затем аспирируйте раствор для диссоциации и осторожно промойте клетки дважды с помощью DPBS, добавьте полную среду с заменой сыворотки (serum replacement) и бессывороточную среду для культивирования, после чего аккуратно снимите клетки с поверхности чашки для культивирования путем соскабливания. С помощью скребка для клеток перенесите их в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте чашку для культивирования дважды, используя полную среду с заменой сыворотки.

Осторожно промойте клетки бессерым средой, чтобы смыть все неотделившиеся клетки. Соберите среду после обоих промываний вместе с клетками в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы осадить клетки, не повреждая клеточный осадок.

Осторожно аспирируйте и удалите супернатант. Аккуратно постучите по пробирке, чтобы полностью отделить осадок клеток от дна. Осторожно ресуспендируйте клетки в полной среде с заменителем сыворотки.

С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте бесфидерную среду. Не титруйте. Перенесите клетки в новую чашку с покрытием GelTrac диаметром 60 мм с соблюдением требуемого коэффициента рассева.

Несколько раз перемещайте чашку с культурой вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки по ее поверхности. На следующий день поместите чашку с культурой в инкубатор при 37 °C с увлажненной атмосферой, содержащей от 4 до 6% carbon dioxide в воздухе. Осторожно замените отработанную среду на полную среду для замены сыворотки.

Подача свежей среды для удаления клеточного дебриса. В дальнейшем заменяйте отработанную среду ежедневно. На этом фазово-контрастном изображении показаны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, выращенные в культурах чашках с покрытием gelt TRX с использованием полноценной среды-заменителя сыворотки без использования фидерного слоя.

Морфология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) схожа с морфологией эмбриональных стволовых клеток человека и характеризуется крупными ядрами и малым количеством цитоплазмы. Иммуноокрашивание показывает, что ИПСК, культивируемые в среде с заменителем сыворотки KnockOut и коктейлем факторов роста, экспрессируют плюрипотентные маркеры OCT4 и SSEA4. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как адаптировать и поддерживать ваши ИПСК в бессывороточных условиях с использованием заменителя сыворотки KnockOut и без использования фидерного слоя. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.