Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Общая цель этой процедуры заключается в криоконсервации и восстановлении клеток IPS в условиях культивирования на основе фидера или без него. Это достигается путем начала упаковки ПИПК в обычном режиме. Вторым этапом процедуры является перевод клеток в свободную от сыворотки замораживающую среду.

Третьим этапом процедуры является криоконсервация, как обычно. Заключительным этапом процедуры является размораживание клеток и начало технического обслуживания. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают успешное замораживание и размораживание IPS-клеток в свободно замораживающей среде сыворотки за счет здоровой морфологии и восстановления после оттаивания.

Привет, меня зовут Кейт Вагнер, я работаю на сайте GCO в Life Technologies. Визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение, потому что ИПК могут быть очень чувствительны к замерзанию и тонкому T. Что делает этот протокол проще, так это то, что замену нокаутирующей сыворотки можно использовать на протяжении всего рабочего процесса.

На сегодняшний день семейство продуктов KSR включает в себя полный список сред и реагентов для кормовой и свободной от ксиноинобактерий культуры эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. KSR может быть использован для выращивания деривации, криоконсервации, расширения и первых начальных этапов дифференцировки. В следующем видео вы покажете, как вы размораживаете и замораживаете себя с помощью KSR в автомате Peter free.

Для начала этой процедуры. Сначала прогрейте в соответствующем количестве полную кормушку свободной средой до 37 градусов Цельсия на водяной бане отсадите отработанную среду из питательного сосуда, который представляет собой 60-миллиметровую посуду. В этом случае индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека дважды промывают DPBS.

Затем добавьте в блюдо один миллилитр диспа. Выдерживайте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. После этого аспирируйте раствор диспа и аккуратно промойте клетки с помощью DPBS.

Затем добавьте полную среду без кормушки, чтобы накрыть миску, и с помощью скребка для клеток аккуратно соскребите клетки, перенесите клетки в стерильную 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Ополосните посуду с полноценным кормом свободной среды, аккуратно распыляя все ячейки, которые не отделились. Перелейте раствор для полоскания в ту же 15-миллилитровую пробирку, в которой находятся клетки.

Ополосните чашку второй раз средой и вытяните раствор для полоскания с ячейками гранул путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение трех минут при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Осторожно переверните трубку, чтобы полностью выбить клеточную гранулу со дна пробирки.

Затем добавьте один миллилитр замораживающей среды А с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки и ресуспендируйте клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз. После равномерной суспензии комков добавьте один миллилитр замораживающей среды B в пробирку по каплям, осторожно взбалтывая клеточную суспензию для перемешивания. Выделите по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую криомерную морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь в камере изопропанола.

На следующий день переложите флаконы с ячейками в емкость с жидким азотом для длительного хранения. Быстро разморозьте замороженный флакон клеток, поместив его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия примерно на три-четыре минуты, пока во флаконе не не останется лишь небольшой замороженный кусочек. После извлечения флакона из водяной бани распылите пульверизатор с 70% изопропанолом для его обеззараживания, затем с помощью пятимиллилитровой пипетки асептически переложите все содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Следующий шаг может быть самым сложным аспектом процедуры. Питательную среду нужно медленно и осторожно добавлять в клетки. Для уменьшения осмотического шока Медленно добавьте четыре миллилитра полной свободной питательной среды по каплям в клетки в конической трубке объемом 15 миллилитров.

Во время добавления среды осторожно двигайте трубку вперед и назад, чтобы перемешать клетки. Это уменьшит осмотический шок для клеток. Полная среда без питательного устройства может быть заменена нокаутной заменой сыворотки, содержащей кондиционированную среду с метамфетамином, или нокаутной заменительной средой для использования с кормушками, инструкции по приготовлению среды см. в тексте протокола.

После того, как все четыре миллилитра среды были добавлены, центрифугируйте ячейки при 1000 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования тщательно аспирируйте и выбросьте вменяемое, не потревожив клеточную гранулу. Аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в четырех миллилитрах полной питательной среды, не содержащей питательных веществ.

С помощью пятимиллилитровой пипетки аккуратно добавьте клеточную суспензию по каплям в покрытую гелем 60-миллиметровую чашку для культур. Поместите чашку для культивирования в инкубатор с температурой от 36 до 38 градусов Цельсия с увлажненной атмосферой от четырех до 6% углекислого газа в воздухе. Осторожно поворачивайте чашку с севера на юг, с востока на запад, чтобы равномерно распределить ячейки.

Через 24 часа после оттаивания. Замените среду в блюде на свежую среднюю. После этого ежедневно восполняйте отработанную среду до тех пор, пока клетки не станут примерно на 70-80% сливающимися.

На этом контрастном изображении показаны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, выращенные на чашках для культур, покрытых гелевым покрытием TRX, с использованием полной замены сыворотки, не содержащей питательной среды. МПК имеют морфологию, аналогичную человеческим эмбриональным стволовым клеткам, характеризующимся большими ядрами и скудной цитоплазмой. Пример замены сыворотки после размораживания и нокаута.

Здесь показана безпитательная среда на гелте TrackX. Следуя этой процедуре, важно помнить, что все клеточные колонии должны иметь одинаковый размер. При криоконсервации это улучшает восстановление клеток.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.