Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Общая цель данной процедуры заключается в криоконсервации и последующем восстановлении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в условиях культивирования с использованием фидерного слоя или без него. Это достигается путем стандартной подготовки клеток к замораживанию, после чего на втором этапе клетки переносят в безсывороточную среду для замораживания.

Третьим этапом процедуры является криоконсервация в обычном режиме. Заключительным этапом является размораживание клеток и начало их поддержания. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие успешную заморозку и размораживание ИПС-клеток в безсывороточном среде для замораживания, что подтверждается здоровой морфологией и восстановлением после размораживания.

Здравствуйте, я Кейт Вагнер из центра GCO компании Life Technologies. Визуальная демонстрация данного протокола крайне важна, так как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) могут быть очень чувствительны к замораживанию и температурному режиму. Облегчает выполнение этого протокола использование заменителя сыворотки KnockOut на всех этапах рабочего процесса.

Сегодня семейство продуктов KSR включает полный перечень сред и реагентов для культивирования эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием фидерного слоя, без фидера и без компонентов животного происхождения. KSR может быть использован для получения, выращивания, криоконсервации, экспансии и начальных этапов дифференцировки. В следующем видео будет показан процесс размораживания и замораживания клеток с использованием KSR в безфидерном режиме.

Для начала данной процедуры сначала подогрейте подходящее количество полной безсывороточной среды для поддержки (feeder-free medium) до 37 °C на водяной бане, после чего аспирируйте отработанную среду из культурального сосуда (в данном случае — чашки диаметром 60 мм). Затем дважды промойте индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека раствором DPBS.

Затем добавьте в лунку один миллилитр раствора Dispa. Инкубируйте лунку при 37 °C в течение трех минут. После этого аспирируйте раствор Dispa и осторожно промойте клетки DPBS.

Затем добавьте полную безсывороточную среду (feeder-free medium), чтобы покрыть поверхность чашки, и с помощью скребка для клеток осторожно соберите клетки, перенеся их в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте чашку полной безсывороточной средой, аккуратно смывая любые клетки, которые не отделились. Перенесите раствор для промывки в ту же пробирку объемом 15 мл с клетками.

Промойте чашку второй раз средой и соберите этот промывочный раствор с клетками; осадите клетки путем центрифугирования при 1000 RPM в течение трех минут при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно аспирируйте и удалите супернатант, не затрагивая осадок клеток. Аккуратно встряхните пробирку, чтобы полностью отделить осадок клеток от дна пробирки.

Затем с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки добавьте 1 mL среды для замораживания A и ресуспендируйте клетки, осторожно перемешивая их пипетированием вверх-вниз. После достижения однородности суспензии сгустков по каплям добавьте в пробирку 1 mL среды для замораживания B, осторожно перемешивая клеточную суспензию круговыми движениями. Распределите по 1 mL клеточной суспензии в каждую криопробирку и заморозьте клетки при температуре -80 °C на ночь в камере с изопропанолом.

На следующий день перенесите пробирки с клетками в резервуар с жидким азотом для длительного хранения. Быстро разморозьте замороженную пробирку с клетками, поместив ее в водяную баню при 37 °C примерно на три-четыре минуты, пока в пробирке не останется лишь небольшой фрагмент льда. После извлечения пробирки из водяной бани обработайте ее 70% изопропанолом для деконтаминации, затем с помощью дозатора на 5 мл асептически перенесите все содержимое пробирки в коническую пробирку объемом 15 мл.

Следующий этап может оказаться самым сложным аспектом процедуры. Безсывороточную среду (feeder free medium) необходимо добавлять к клеткам медленно и осторожно. Чтобы уменьшить осмотический шок, медленно и по каплям добавьте 4 мл полной безсывороточной среды к клеткам в 15-миллилитровой конической пробирке.

При добавлении среды осторожно перемещайте пробирку вперед-назад, чтобы перемешать клетки. Это позволит снизить осмотический шок клеток. Полноценную среду без фидерного слоя можно заменить на заменитель сыворотки KnockOut, содержащий кондиционированную среду meth, или среду с заменителем сыворотки KnockOut для использования с фидерным слоем; инструкции по приготовлению сред см. в тексте протокола.

После добавления всех четырех миллилитров среды центрифугируйте клетки при 1000 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования аккуратно аспирируйте и удалите супернатант, не затрагивая осадок клеток. Осторожно ресуспендируйте осадок клеток в четырех миллилитрах полной среды без фидерного слоя.

С помощью пипетки на 5 мл осторожно добавьте суспензию клеток по каплям в 60-миллиметровую культуральную чашку, покрытую GelTrac. Поместите чашку в инкубатор при температуре 36–38 °C с увлажненной атмосферой, содержащей 4–6% CO2 в воздухе. Осторожно покачайте чашку круговыми движениями по оси север-юг и восток-запад для равномерного распределения клеток.

Через 24 часа после размораживания замените среду в чашке на свежую. В дальнейшем ежедневно заменяйте отработанную среду до тех пор, пока клетки не достигнут примерно 70–80% конфлюэнтности.

На этом контрастном изображении показаны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, выращенные в культуральных чашках с покрытием из GelTrac с использованием полной среды без фидерных клеток с заменителем сыворотки. иПСК демонстрируют морфологию, схожую с эмбриональными стволовыми клетками человека, которая характеризуется крупными ядрами и малым количеством цитоплазмы. Пример клеток после размораживания и в среде с заменителем сыворотки KnockOut.

Здесь представлена бесфидерная среда на гель-треке TrackX. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать одинаковый размер всех колоний клеток. При криоконсервации это способствует лучшему восстановлению клеток.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.