Индукция и клинической Подсчет очков Хронический рецидивирующий-экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Меня зовут Кристин Битон. Я ассистент-исследователь в лаборатории Джорджа Чена на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. В ближайшие несколько дней я покажу вам, как индуцировать и мониторировать хронический рецидивирующий EAE, что означает экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, у крыс линии DA.

Это модель рассеянного склероза на животных, или, вернее, одна из моделей рассеянного склероза на животных. Она характеризуется развитием восходящего вялого паралича у этих животных и гистологическими признаками, напоминающими течение заболевания у человека. Процедура займет несколько дней.

В первый день я покажу вам, как приготовить генную эмульсию с гомогенатом спинного мозга наивных крыс в полном адъюванте Complete Trans. Во второй день я продемонстрирую процесс иммунизации крыс для моделирования ЭАЭ (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита), после чего мы подождем от 7 до 15 дней до появления первых клинических признаков у животных; в этот момент я покажу вам различные стадии прогрессирования ЭАЭ у разных животных. Для начала я представлю все реагенты и материалы, необходимые для приготовления эмульсии.

Я использую полный адъювант H 37 ra; несмотря на то, что он уже содержит Mycobacterium tuberculosis, я дополню его до концентрации 4 мг/мл, добавив дополнительно высушенные Mycobacterium tuberculosis H 37 ra. Для подготовки этих высушенных бактерий мне необходимо поместить их в ступку и с помощью пестика растереть в тонкий порошок. После этого я добавлю данные бактерии в адъювант.

Теперь адъювант готов. Следующий шаг — подготовка антигена. Я достану спинные мозги крыс, замороженные при температуре -80 °C, и, чтобы они оставались полностью замороженными, помещу их в чашку для взвешивания на сухой лед. Затем я буду извлекать их по одному и с помощью обычных лезвий бритвы измельчать спинной мозг непосредственно в чашках для взвешивания.

Теперь я помещу адъювант с добавками на вортекс. В процессе перемешивания я буду постепенно добавлять спинной мозг в адъювант. После того как весь спинной мозг будет смешан с адъювантом, мы продолжим перемешивание на вортексе еще в течение пяти минут, после чего перенесем приготовленную эмульсию в стеклянные шприцы объемом 5 мл.

Мы соединим два стеклянных шприца объемом 5 мл с помощью мостика 16 G и будем перегонять эмульсию из одного шприца в другой с максимально возможной для данного мостика скоростью. Через несколько минут, когда эмульсия начнет становиться более густой, мы перейдем на мостик меньшего диаметра. Здесь используется 18 G, что сделает эмульсию еще гуще; далее мы оставим ее в этих шприцах с данным мостиком, обернув алюминиевой фольгой, на ночь в холодильнике.

Я отвесил 30 mg Mycobacterium tuberculosis на весовую бумагу. Затем я перенес их в ступку и с помощью пестика растирал агрегаты бактерий до состояния тонкого порошка.

Однако не следует слишком сильно нажимать пестиком, чтобы не разрушить бактерии. В начале процедуры бактерии в агрегатах имеют желтовато-бежевый цвет. Если вы добьетесь получения очень мелкого порошка, в итоге получится белый порошок, чего и необходимо достичь, но при этом нельзя давить слишком сильно, чтобы не повредить бактерии.

После этого я взял ампулу объемом 10 мл с адъювантом Complete Trans, предварительно убедившись, что все бактерии находятся во взвеси. Я вскрыл эту ампулу и вылил все 10 мл адъюванта Complete Trans в ступку на дезагрегированные mycobacterium tuberculosis. Теперь я перенесу дополненный адъювант Complete Trans в пробирку объемом 50 мл.

Теперь я переношу дополненный полный адъювант в пробирку. Разумеется, бактерии осели на дно жидкости, и я постараюсь перенести их в пробирку максимально полно. Однако если часть бактерий останется в ступке, это не станет проблемой, так как я буду использовать эту же ступку без предварительной очистки для приготовления эмульсии спинного мозга.

Перед нами образцы спинного мозга. Они хранились в замороженном состоянии при температуре -80 °C. Я отвесил 10 г образцов, чтобы добавить их в 10 мл моего дополненного адъюванта.

Теперь я измельчу спинные мозги в чашках для взвешивания с помощью лезвий бритвы, стараясь как можно дольше сохранять их в замороженном состоянии. Для максимально мелкого измельчения спинного мозга вам понадобятся два лезвия бритвы и чашка для взвешивания. Я помещаю один спинной мозг в чашку для взвешивания и начинаю его разрезать; при этом я прикрываю образец рукой, так как из-за замороженного состояния кусочки будут разлетаться. Сначала я разделяю его на крупные части, после чего образец начнет очень быстро оттаивать и прилипать к лезвию бритвы.

Затем я использую другое лезвие, чтобы снять его, и стараюсь измельчить ткань как можно мельче и быстрее, чтобы она не успела расплавиться, так как после плавления ее гораздо труднее резать. Поэтому крайне важно, чтобы спинной мозг был полностью и очень мелко измельчен, поскольку чем мельче будет фракция, тем более однородным будет инокулят, и тем больше крыс заболеют с более однородным течением болезни. Таким образом, очень важно очень тщательно измельчить все эти образцы спинного мозга.

Теперь я буду измельчать каждый фрагмент спинного мозга точно таким же образом, пока не обработаю все 10 граммов ткани. Сейчас я немного перемешаю содержимое ступки, чтобы убедиться, что собрал все частицы Mycobacterium tuberculosis, оставшиеся в ступке после добавления адъюванта. Далее я помещу адъювант на вортекс.

Продолжая максимально интенсивно перемешивать смесь на вортексе, я буду постепенно добавлять гомогенат спинного мозга в этот адъювант. Таким образом, сейчас в вортексе находится адъювант с добавками, и я начинаю понемногу добавлять гомогенат спинного мозга. Причина, по которой я добавляю антиген в адъювант очень медленно, заключается в том, что мы создаем эмульсию типа «вода в масле».

Таким образом, адъювант состоит преимущественно из минерального масла, а антиген представляет собой эквивалентный раствор. Нам необходимо очень медленно смешивать антиген с маслом, чтобы при каждом добавлении масло полностью обволакивало антиген. Если добавить его однократно, полное покрытие антигена не будет достигнуто.

Теперь я добавил весь гомогенизат спинного мозга к адъюванту на вортексе и оставил пробирку вращаться еще на пять минут, чтобы обеспечить полное перемешивание. Я отрегулировал скорость так, чтобы добиться максимально интенсивного перемешивания, при этом не теряя слишком много содержимого из пробирки. Прошло пять минут вортексирования, теперь я остановлю прибор и перенесу полученную смесь в стеклянные шприцы.

Таким образом, я собрал шприц целиком. Я прикрепил его к перемычке большего диаметра, а к другому концу перемычки я прикрепил только цилиндр одного шприца, и теперь я собираюсь добавить эмульсию в этот шприц. Итак, теперь, нет.

Теперь я перенесу всю жидкость в нижний шприц, отсоединю верхний, закончу его сборку и удостоверюсь в отсутствии пузырьков воздуха в нижнем шприце и в соединительном мостике. Теперь я присоединю их снова. Таким образом, оба шприца соединены друг с другом с помощью этого мостика.

Один шприц заполнен иммерсионной жидкостью, другой пуст. Теперь я буду максимально быстро перемещать поршень из одного шприца в другой и обратно. После этого я заменю иглу большого диаметра на иглу меньшего диаметра — 18 G.

Использование мостика меньшего размера сделает эмульсию еще более густой. Чтобы заменить мостик, я переношу всю эмульсию в один шприц. Я снимаю пустой шприц, убеждаюсь, что в мостике ничего не осталось, снимаю старый мостик, устанавливаю новый, вытесняю все пузырьки воздуха и снова подсоединяю второй шприц.

Я повторяю эту процедуру; сейчас эмульсию преодолевать гораздо труднее, и я стараюсь не разрушить этот очень хрупкий мостик. Я повторяю эти действия с новым набором шприцев до тех пор, пока в пробирке остается эмульсия. Таким образом, я использую столько шприцев, сколько необходимо, чтобы израсходовать всю эмульсию.

Итак, теперь я перемешал эмульсию несколько раз, примерно 10–15 раз, но это количество варьируется от партии к партии. Сейчас смесь становится очень густой, и перемешивать её становится крайне трудно. Я сделаю это еще пару раз, ну, или, может быть, нет.

Теперь оно застряло окончательно, поэтому я оставлю его в этом положении. В противном случае существует риск сломать либо шприц, либо мостик. Таким образом, если движение прекращается слишком рано, это может означать, что мостик засорился.

На данном этапе, поскольку я перемешал смесь как минимум 10 или 15 раз, это означает, что эмульсия готова. Она очень густая, поэтому ее следует оставить в покое. Теперь я оберну ее алюминиевой фольгой и помещу в холодильник на ночь.

Вчера мы подготовили эмульсию с фрагментами красного вещества спинного мозга и оставили ее в холодильнике на ночь. Сегодня мы достаем ее и будем вводить крысам по 200 µL в основание хвоста. Однако перед инъекцией необходимо убедиться в качестве эмульсии.

Таким образом, эмульсия должна оставаться однородной, и она по-прежнему представляет собой качественную однородную систему. Трещина, которую вы здесь видите, даже подтверждает, что система однородна и не расслоилась на две фазы, что было бы нежелательно. Следовательно, данная эмульсия пригодна для использования.

Таким образом, в каждый отдельный отсек вводится 200 µL нашей эмульсии. Для инъекции мы используем шприцы объемом 3 мл, при этом обязательно выбираем шприцы с Luer-Lock соединением, так как при использовании шприцев со скользящим наконечником из-за высокой вязкости эмульсии игла может выскочить во время введения.

Поэтому всегда используйте шприц с замком Люэра. В качестве иглы мы стараемся выбрать максимально тонкую, но из-за высокой вязкости данной эмульсии нам приходится использовать иглу 20G. Поскольку инъекцию необходимо ввести очень точно в основание хвоста, мы анестезируем крыс на несколько минут и, пока животные находятся в глубоком сне, успеваем их промаркировать.

Мы используем перфорацию ушных раковин, и каждая крыса идентифицируется по специфическому рисунку проколов. Теперь мы готовы к инъекциям: каждой крысе в основание хвоста будет введено 200 µL эмульсии, и одновременно с этим мы отметим уши. Я готовлю эмульсию в шприце для одной крысы за раз, поскольку вводить препарат часто бывает очень трудно и приходится сильно давить на поршень, а я не хочу ввести крысе больше необходимого объема.

Таким образом, я заполняю шприц для одной единицы HU за раз. Чтобы заполнить шприц, я соединяю пластиковый инъекционный шприц с переходом, который, в свою очередь, соединен со стеклянным шприцем, содержащим эмульсию. Я набираю в пластиковый шприц около 300 µL эмульсии.

Затем я подключаю иглу и вытесняю из нее воздух, чтобы избежать потери 50 мкл объема в мертвом пространстве иглы. Я убеждаюсь, что в шприце находится ровно 200 мкл, после чего ввожу препарат в основание хвоста крысы. Теперь, когда все инъекции в сердце завершены, мы будем проводить ежедневный мониторинг.

Таким образом, мы будем взвешивать их каждое утро и дважды в день проверять на наличие клинических признаков ЭАЭ. Первыми признаками, которые я покажу вам по мере их появления, будет вялый хвост; мы ожидаем, что у первых крыс эти признаки проявятся примерно на седьмой-восьмой день после инъекции. Большинство крыс заболеют в период с 10-го по 12-й день, а последние — примерно на 15–17 день.

Прошло 13 дней после иммунизации сердец эмульсией спинного мозга, и теперь я приступлю к мониторингу этих животных для оценки их клинического состояния. Но прежде чем я это сделаю, позвольте рассказать вам о том, как мы содержим наших животных. При аутоиммунных заболеваниях характерно, что любое присутствие патогена в организме животного будет снижать аутоиммунный ответ.

Чтобы максимально этого избежать, мы содержим крыс в специфических условиях. Они находятся в данной кабине с фильтруемым воздухом и избыточным давлением, при этом сами животные размещены в автоклавированных клетках. Таким образом, абсолютно всё в клетке проходит автоклавирование перед тем, как мы поселяем туда крысу.

Сверху на клетках установлены фильтры. В качестве корма используется стандартный корм для грызунов. Он был закуплен в компании I originated.

Также мы даем крысам подкисленную воду. Мы берем обычную питьевую воду и добавляем соляную кислоту согласно стандартным протоколам; подкисленная вода используется для поддержания кишечной микрофлоры на минимальном уровне, что снижает риск нарушения аутоиммунного ответа. Теперь я готова приступить к клинической оценке состояния крыс.

Оценка проводится по шкале от нуля, что соответствует отсутствию клинических признаков, до шести, что означает терминальное состояние, при котором животное подлежит эвтаназии. Сейчас я пошагово продемонстрирую вам примеры каждого клинического показателя, которые могут наблюдаться в данной модели. На данный момент идет 13-й день после иммунизации крыс препаратом UCAE.

И в этой клетке у меня есть две крысы, которые еще не заболели. Таким образом, у них совершенно нет клинических признаков заболевания. Обе крысы по-прежнему здоровы.

Они активно перемещаются, и, как видно, при движении они приподнимают хвост над подстилкой. Иногда они дают хвосту обсохнуть, но чаще всего стараются приподнять его над подстилкой. Если предоставляется возможность, они также вылезают из клетки, что означает полный контроль над всеми четырьмя конечностями и способность вставать при необходимости.

Таким образом, первым клиническим признаком экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EA) является вялый хвост. Если я возьму крысу и надавлю пальцем на хвост, крыса будет стремиться ухватить палец кончиком хвоста. Как вы только что видели, у этой крысы нет вялого хвоста, и я могу проверить это на другой особи.

Хвост обхватывает палец, что означает, что у этих крыс полностью сохранен рефлекс хвоста. Их клинический балл равен нулю, что фактически означает полное отсутствие заболевания. А вот крыса, клинический балл которой составляет 0,5.

Таким образом, при простом наблюдении в клетке животное ведет себя абсолютно нормально: оно бегает, забирается на стенки клетки, однако кончик хвоста никогда не отрывается от подстилки. Это может свидетельствовать о частичном повреждении хвоста у данной крысы. В таком случае я беру крысу и провожу тот же тест; несмотря на то, что в хвосте сохраняется некоторый тонус, его конец не обхватывает мой палец полностью.

Таким образом, я присваиваю этой крысе балл 1,5, что соответствует частичному вялому хвосту. Клинический балл 1 характеризуется полностью вялым хвостом, когда ни одна часть хвоста не имеет тонуса, но крыса все еще может использовать задние конечности. Как видно, эта крыса опирается на стенку клетки, что свидетельствует о нормальном функционировании задних лап.

Однако если я проверю хвосты этих крыс, приподняв их, то обнаружится полное отсутствие тонуса. Другой тест, который можно провести, когда животное находится на дне клетки: если приподнять хвост нормальной крысы, он будет опускаться медленно, в то время как хвост крысы с баллом один может даже не достичь поверхности. Если же приподнять хвост крысы с более тяжелым поражением, он мгновенно упадет на землю.

Эта RU может двигать всеми четырьмя конечностями, однако задние конечности слишком слабы, чтобы позволить этой RU встать. Поэтому я присвою данной RU клинический балл два. Таким образом, основное различие между баллом один и двумя заключается в том, что балл один соответствует только вялому хвосту.

Задние конечности полностью функциональны; при оценке в три балла крыса заваливалась бы на бок. Два балла — это промежуточное состояние, при котором крыса может использовать задние конечности, но они значительно слабее, чем у здоровой крысы. Таким образом, у данной крысы наблюдается необычный признак ЭАЭ.

Обычно ЭАЭ характеризуется восходящим вялым параличом, однако в некоторых, довольно редких случаях, подобных этому, у крыс сначала развивается паралич передних конечностей, а затем — задних. Именно это наблюдается у данной крысы. Если посмотреть, видно, что голова находится ниже остального тела, так как крысе трудно пользоваться передними конечностями, и она не может забраться на стенку клетки.

И хотя его задние конечности функционируют нормально, он не может отталкиваться передними конечностями. Поэтому я бы по-прежнему присвоил этой крысе два балла, что соответствует легким парезам, хотя обычно мы наблюдаем это в отношении задних конечностей в данной группе RU, а здесь мы видим это во всех четырех конечностях. Таким образом, данная RU имеет гораздо более тяжелый фенотип, чем предыдущие.

Клинический балл составляет три. Как я вам сейчас покажу, передние конечности функционируют абсолютно нормально, однако обе задние конечности имеют умеренный парез. Таким образом, обе задние конечности используются животным для передвижения, но животное заваливается на бок и не может полностью контролировать эти ноги.

Эти споры становятся гораздо слабее, чем они были бы в норме без EE. И на этом этапе нас больше не беспокоят вялые хвосты, так как у многих из этих крыс через некоторое время хвост становится очень жестким. Таким образом, у этой особи хвост все еще очень вялый, но иногда можно заметить дистонию. В результате хвост начинает двигаться нескоординированно.

На этом уровне мы больше не оцениваем хвост, а смотрим только на работу конечностей. Мы присваиваем этому 3,5 балла, так как при осмотре задних конечностей видно, что одна из них двигается, в то время как другая полностью парализована и совершенно не помогает крысе продвигаться вперед. Таким образом, это считается полным параличом одной задней конечности, что соответствует оценке 3,5.

У этой крысы клинический балл равен четырем, что означает полный паралич задних конечностей, который характеризуется полной невозможностью двигать задними ногами. У крысы в этой клетке клинический балл равен пяти, что соответствует полному параличу задних конечностей с дополнительным недержанием. Это животное страдает недержанием; как мы видим, эта область полностью намокла, чего не наблюдается у других животных, у которых нет недержания.

Когда баллы наших HUS составляют три или более, мы предоставляем им бутылочки с водой с длинными питьевыми трубками, чтобы гарантировать доступ к воде. Также мы размещаем корм на дне клетки и даем им гелевые пакеты. Но несмотря на все эти меры, каждый раз, когда мы вынимаем крыс для мониторинга, что делается дважды в день, мы всегда предлагаем им воду на случай, если за день они не получили ее в достаточном количестве.

Перед нами крыса с клиническим баллом четыре. На этой стадии животным требуется небольшое стимулирование к приему пищи. Поэтому я размачиваю их корм, чтобы им было гораздо легче его пережевывать.

За последние две недели я продемонстрировал вам, как индуцировать и контролировать течение хронического рецидивирующего ЭАЭ у крыс линии DA. На первом этапе я показал, как готовить суспензию для погружения спинного мозга, а затем — как вводить её в основание хвоста этих крыс. И сегодня я показал вам, как оценивать степень выраженности заболевания у этих крыс по различным уровням.

Разумеется, это модель хронического рецидивирующего заболевания, поэтому мы ожидаем колебаний показателей у крыс. Через несколько дней болезнь уйдет в ремиссию, после чего со временем произойдет рецидив. У некоторых крыс заболевание перейдет в более хроническую фазу.

Результаты будут варьироваться от животного к животному. В завершение этого видео я хочу подчеркнуть один момент относительно тестирования препаратов на таких моделях. Очень важно максимально качественно рандомизировать животных.

Очень важно учитывать, что чем раньше животное заболевает, тем тяжелее протекает болезнь. Поэтому нельзя объединять все контрольные животные в первый день, а подопытные животные — в последующие дни. Мы действуем следующим образом: как только животное заболевает и наступает день начала лечения, мы случайным образом распределяем животных по двум разным группам.

Если у нас есть, например, одна контрольная и одна опытная группа, то первое сердце попадает в контрольную группу, второе — в опытную и так далее, пока все животные не будут распределены по своим группам. При этом мы следим за тем, чтобы эта рандомизация происходила как можно раньше в ходе выполнения протокола. Надеюсь, это видео было вам полезно и теперь вы сможете индуцировать и мониторировать хронический рецидивирующий ЭАЭ у крыс линии D.

И удачи в ваших экспериментах.