Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Общая цель следующего эксперимента заключается в поиске малых молекул, которые специфически модулируют ключевые аспекты эмбрионального развития и физиологии. Это достигается путем помещения большого количества оплодотворенных яиц в 96-луночные планшеты, которые на втором этапе используются для скрининга. Аликвоты библиотеки малых молекул добавляются в 96-луночные планшеты к эмбрионам.

Луночные планшеты исследуют на наличие фенотипов, вызванных действием малых молекул. Полученные результаты показывают, какие именно малые молекулы специфически влияют на развитие или физиологию super fish. Здравствуйте, меня зовут Чарльз Хонг, я представляю Медицинский колледж Университета Вандербильта.

В нашей лаборатории мы проводим высокопроизводительный химический скрининг с использованием эмбрионов Danio rerio. Это относительно простой метод, который может быть широко адаптирован для поиска новых биоактивных соединений. Днем накануне проведения химического скрининга подготовьте от 10 до 20 аквариумов для разведения zebrafish.

Установите разделитель в каждый аквариум и наполните их водой из системы аквакультуры; с помощью сачка перенесите одного взрослого самца и одну-две взрослые самки во внутренний контейнер. Утром в день проведения эксперимента промаркируйте каждый репродуктивный аквариум и накройте их крышками. Извлеките разделители из репродуктивных аквариумов, чтобы дать данио-рерио возможность спариться.

В течение следующего часа дайте оплодотворенным икринкам провалиться сквозь сетку в нижней части каждого внутреннего контейнера. Спустя один час верните взрослых особей рыбы зебра обратно в резервуары для постоянного содержания.

Извлеките внутренний контейнер и соберите икру, процедив воду из каждого нерестового аквариума через пластическое ситечко для чая. Переверните ситечко над чашкой Петри и аккуратно промойте его, чтобы икринки переместились в чашку. С помощью промывочной бутыли с питательной средой E three удалите все неоплодотворенные икринки, которые выглядят непрозрачными.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки из каждого скрещивания должно получиться примерно 200 эмбрионов. Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите примерно по пять эмбрионов в среде E3 в каждую лунку 96-луночного планшета. После этого эмбрионы будут распределены по 96-луночному планшету.

Максимально удалите среду E three из лунок с помощью 12-канального дозатора, стараясь не повредить эмбрионы. Затем с помощью 12-канального дозатора внесите 250 µL среды E three.

Как можно быстрее добавьте в каждую лунку среду, содержащую 0,5 µg/mL канамицина, чтобы эмбрионы не пересохли. Поместите планшеты на 96 лунок в инкубатор при температуре 28,5 °C до достижения стадии, на которой необходимо добавить соединения. В данном протоколе мы ищем соединения, нарушающие раннее формирование паттернов эмбриона, и инкубируем эмбрионы в течение трех часов или до тех пор, пока более 90% эмбрионов не достигнут стадии 1000 клеток; библиотеки малых молекул обычно поставляются в таком виде.

Используя исходный 96-луночный планшет, в котором каждое соединение хранится в DMSO в виде стокового раствора с концентрацией 10 millimolar, примерно за 60 минут до того, как эмбрионы достигнут нужной стадии, разморозьте соответствующее количество 96-луночных планшетов, содержащих аликвоты малых молекул. Запишите серийный или иной идентификационный номер исходных планшетов. Чтобы минимизировать образование конденсата на планшетах, поместите их в камеру для высушивания с осушителем.

Кратковременно центрифугируйте планшеты в настольной центрифуге, оснащенной адаптером для многолуночных планшетов. Снимите алюминиевую фольгу с исходного планшета. С помощью 12-канального дозатора разведите соединения в исходном планшете до необходимой концентрации с помощью DMSO. В данном протоколе мы используем конечную концентрацию 0.5 мМ, добавляя 4.75 мкл DMSO для разведения стокового планшета с концентрацией 10 мМ.

Когда эмбрионы в 96-луночном планшете достигнут нужной стадии, с помощью 12-канального дозатора перенесите 2,5 microliters соединений из исходных планшетов в планшеты-реципиенты с эмбрионами. Закройте планшеты, содержащие эмбрионы и соединения, крышками и запишите идентификационный номер исходных планшетов на планшетах с эмбрионами. Перемешайте содержимое планшетов путем осторожного вращения и поместите их в инкубатор при температуре 28,5 degree Celsius.

Накройте каждую исходную планшетку, содержащую неиспользованные малые молекулы, алюминиевой фольгой, закрепите лентой и поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C для длительного хранения. Перед проведением визуального скрининга сформулируйте конкретный критерий отбора «хитов». Например, при скрининге малых молекул-ингибиторов развития переднего мозга «хитом» может считаться соединение, вызывающее потерю переднего мозга.

Отсутствие глаз является простым визуальным индикатором потери переднего мозга и не требует использования флуоресценции для анализа на нужных этапах развития. Извлеките 96-луночные планшеты с эмбрионами, подвергшимися воздействию соединений, из инкубатора и изучите каждую лунку под стереомикроскопом. При скрининге низкомолекулярных ингибиторов развития переднего мозга проверяйте планшеты через 28 часов на наличие отсутствия глаз как маркера ингибирования развития переднего мозга. Запишите номер планшета и номер лунки для каждой лунки, в которой по крайней мере три из пяти эмбрионов проявляют указанный фенотип. Поместите 96-луночный планшет обратно в инкубатор.

Повторно подтвердите отсутствие глаз и переднего мозга через 48 часов. Несмотря на отсутствие переднего мозга, эмбрионы будут жизнеспособны в течение как минимум четырех дней. Подтвердите потенциальный результат, повторно протестировав действие соединения в нескольких дозах; для каждой дозы тестируют 10 эмбрионов в 0,5 миллилитрах среды E3 в формате 48-луночного планшета.

Сроки подготовки соединений для повторного тестирования должны быть идентичны срокам первоначального скрининга. HIIT подтверждается, когда при повторном тестировании соединения воспроизводится вызванный фенотип дозозависимым образом. Наконец, идентифицируйте соединение-хит по базе данных малых молекул в химической библиотеке.

Используя визуальный химический скрининг на базе zebrafish, мы обнаружили малую молекулу-ингибитор передачи сигналов hedgehog, основываясь на её воздействии на ось тела. На данном изображении представлены эмбрионы, подвергшиеся воздействию ингибитора hedgehog, у которых наблюдается выраженный вентральный изгиб хвоста. Эмбрионы, обследованные через 24 часа, при повторном анализе через 48 часов по-прежнему демонстрируют фенотип с вентральным изгибом.

На данном изображении представлен эмбрион, обработанный соединением, в сравнении с эмбрионом с мутацией сигнального пути hedgehog. После освоения этой методики один человек может проводить скрининг примерно 400 соединений в неделю, затратив на это всего несколько часов. Данный метод также открыл химикам-биологам возможность изучать такие процессы, как развитие клеток, клеточные сигнальные пути и эмбриональное развитие.

При работе с нехарактеризованными малыми молекулами важно соблюдать правила техники безопасности, использовать лабораторные халаты и перчатки, так как такие нехарактеризованные молекулы могут быть потенциально опасны.