Опробование β-амилоида Токсичность использованием трансгенных С. Элеганс Модель

Общая цель данного эксперимента заключается в определении токсичности бета-амилоидного пептида в модельной системе InVivo. Воспроизводимость и относительная простота этого анализа позволяют проводить быстрое тестирование лекарств, условий окружающей среды или генетических модификаций на токсичность бета-амилоида. Ключевым фактором в разработке этого анализа является получение трансгенных червей cl egan's с мышечной специфической температурой, индуцируемой экспрессией бета-амилоидного пептида.

Эта чувствительная к температуре экспрессия конструируется путем конструирования трансгена, содержащего аномально длинную нетранслируемую область из трех простых чисел, что делает мРНК трансгена мишенью для надзора за мРНК, поэтому экспрессия этого трансгена слаба у червей дикого типа с функциональной системой надзора за мРНК из-за деградации трансгена мРНК. Если этот трансген вводится в генетический фон, который содержит мутацию в важном компоненте системы надзора за мРНК, экспрессия трансгена будет значительно выше. Если генетический фон содержит чувствительную к температуре мутацию в системе надзора за мРНК, то размножение этого траншеечного штамма при неразрешающей температуре будет блокировать деградацию мРНК гена траншеи и приведет к тому, что траншееновые черви с высокой экспрессией траншейных генов будут использовать эту систему для регулирования мышечной экспрессии бета-амилоидного пептида при повышении температуры с 16 ° Цельсия до 25 ° Цельсия. приводит к высокому накоплению бета-амилоидного пептида, дисфункции мышечных клеток и параличу червей в измерении времени.

Требуется популяция этих траншейных червей, чтобы стать парализованной после температуры. Upshift является чувствительным анализом на токсичность бета-амилоида. Это достигается за счет изготовления свежих нематодных питательных сред для анализа на паралич, что помогает свести к минимуму переменные окружающей среды, которые могут влиять на уровень паралича.

В качестве второго шага, синхронизированные по возрасту популяции траншейных червей или инициированные, это сводит к минимуму влияние стадии развития на экспрессию трансгенов. Далее, синхронизированные третьи личиночные стадии повышаются с 16 градусов Цельсия до 25 градусов Цельсия, повышая стабильность трансгенной мРНК и приводя к накоплению бета-амилоидного пептида. Измерение времени от перехода на повышенную передачу до паралича для каждого червя фиксирует скорость мышечной дисфункции, тем самым анализируя токсические эффекты накопления бета-амилоидного пептида, результаты которого показывают влияние специфических методов лечения на токсичность эндогенно экспрессируемого бета-амилоидного пептида.

Таким образом, основное преимущество нашего метода, в отличие от использования трансгенных мышиных моделей для анализа активности лекарств, заключается в том, что мы можем сделать это гораздо быстрее и с меньшими затратами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Оценка L-четырех червей в анализе на паралич очень сложна для изучения.

Поэтому, когда вы оцениваете парализованного червя L-4, то, на что вы хотите обратить внимание, — это изолированное движение ореола в области головы червя. Как только червь начинает двигаться и все тело червя парализовано, мы оцениваем его как парализованного. Эссе о параличе выполняется на планшетах стандартной питательной среды для нематод или NGM, обычно используемых для размножения и генетики CL-egan.

Для приготовления планшетами автоклава раствор НГМ содержит хлорид натрия, агар и пептид в колбе Эрленмейера, затем добавляют соответствующие количества следующих стерильных растворов, которые можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Квотируйте 10 миллилитров жидкого НГМ в каждую чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров. Дайте NGM застыть в течение ночи при комнатной температуре.

При тестировании на воздействие соединений или экстрактов нанесите экстракт на каждую пластину и используйте разбрасыватель, чтобы равномерно распределить его по поверхности пластины. Дайте пластинам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Объемы свыше одного миллилитра потребуют больше времени для сушки.

Затем поместите на каждую пластину 250 микролитров кишечной палочки штамма OP 50, выращенного в среде LB в течение ночи до оптической плотности от 0,4 до 0,6, дайте бактериям высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Возраст пластины оказывает значительное влияние на частоту паралича, и поэтому старые пластины имеют тенденцию к высыханию. Пластины следует залить в течение одной недели после проведения анализа на паралич.

В идеале, вы хотите использовать тарелки, которые были залиты за три-четыре дня до синхронной закладки яиц Тарелки, используемые в любом эксперименте, должны быть из одной партии, изменяя размер газона, или бактерии также изменят поведение червей. Например, HT one 15 используется в экспериментах с РНК-интерференцией. Однако это может изменить кинетику анализа на паралич.

Поэтому вы должны использовать внутренний контроль, который является подходящим Штаммом. CL 476 чаще всего используется для определения бета-индуцированного паралича. Этот штамм и другие трансгенные модели доступны академическим исследователям за символическую плату в Генетическом центре Святого Ахади.

Для максимизации возрастной синхронности тестовой популяции предпочтительно это. Начните с синхронизированного родительского поколения. За неделю до начала анализа на паралич испытуемой популяции используйте устройство для сбора платиновых червей, чтобы перенести от 20 до 30 взрослых особей на несколько 10-сантиметровых пластин NGM.

Распределите с OP 50 в течение двух часов, отложите яйцо при температуре 16 градусов Цельсия, что является допустимой температурой для CL 4 1 76. Удалите взрослых особей GR и дайте потомству расти в течение семи дней, к этому времени они станут взрослыми особями второго дня. Второй день гравитации.

Взрослые особи используются для подготовки возрастных синхронных тестовых популяций для каждого экспериментального условия. Цель состоит в том, чтобы создать тройные пластины, содержащие синхронных червей в возрасте от 50 до 75 лет, с помощью платинового червячника. Переносите от 10 до 12 дней двух более тяжелых взрослых особей на 60-миллиметровые пластины NGM, отмеченные OP 50. Дайте червям отложить яйца при температуре 16 градусов Цельсия в течение двух часов, затем очистите взрослых особей и дайте яйцам вылупиться и вырасти при температуре 16 градусов Цельсия.

На этом этапе лучше всего, чтобы кто-то, кто не будет оценивать пластины, закодировал их так, чтобы оценка была слепа к экспериментальным условиям. Стадия эмбрионального развития, когда откладываются яйца, которая составляет примерно 26 клеточной стадии для червей дикого типа в оптимальных условиях, является функцией взрослого возраста и питания. Если взрослые особи, используемые для откладки яиц, старше или голодают, яйца будут откладываться на более поздней стадии, и синхронная популяция не будет достигнута, что влияет на кинетику анализа на паралич.

Важно использовать моногенные бактериальные культуры, такие как кишечная палочка, OP 50, поскольку бактериальное загрязнение любого рода может серьезно повлиять на этот анализ. Воспроизводимость наиболее высока, если ваши тройные планшеты имеют одинаковое количество червей для индуцирования трансгена и проведения анализа на паралич. Повышайте передачу пластин до 25 градусов по Цельсию.

Через 48 часов после окончания синхронной кладки яиц червь должен находиться на третьей личиночной стадии. Тарелки должны быть расположены без штабелирования в инкубаторе с температурой 25 градусов Цельсия, чтобы пластины могли достичь этой температуры. В то же время приступайте к оценке паралича червей через 18-20 часов после начала переключения передач.

К этому моменту все черви в популяции должны достичь четвертой личиночной стадии, продолжать подсчет с шагом в два часа, пока все черви на каждой из пластин не будут парализованы. По неизвестным причинам паралич бывает даже не по всей длине тела. Головная область является последней частью червя, которая перестает двигаться.

Таким образом, черви, которые недавно инициировали паралич, не могут перемещаться по пластине, но могут двигать головой, тем самым очищая бактерии вокруг передней части и оставляя ореол очищенных бактерий. Эти черви неизменно становятся полностью парализованными, и поэтому черви с нимбами характеризуются как парализованные. Некоторые черви не будут иметь ореола, но и не будут проявлять спонтанного движения.

Их проверяют путем проталкивания их с помощью червячного пикера. Если подталкиваемый червь не может подвергнуться распространению волны по всему телу, он также оценивается как парализованный для эффективного подсчета очков. Проще всего переместить парализованных червей в непятнистый сектор пластины, чтобы они не были случайно забиты в следующем зачетном периоде.

Это также позволяет неправильно классифицированным червям демонстрировать движение, что позволяет с помощью коррекции оценки генерировать кривую паралича. В каждой временной точке доля червей на каждой пластине, которые не были парализованы, преобразуется в проценты, и средний беспрецедентный процент строится в зависимости от времени с момента начала переключения вверх. Полученная кривая формально аналогична кривой выживаемости и, таким образом, может быть проанализирована с использованием стандартной непараметрической статистики выживаемости.

Для того, чтобы начался паралич, трансгенные бета-черви myo three A должны быть выполнены на средней стадии L-4. Промотор Myo three регулируется в процессе развития. Как только черви достигают позднего L четвертого или взрослого возраста, уровень экспрессии значительно снижается.

Экспрессия трансгена блокируется, если черви голодают, поэтому очень важно, чтобы черви хорошо питались на протяжении всего эксперимента. Мы никогда не наблюдали выздоровления парализованного червя ни при каких условиях. После 12-16 часов работы на повышенную передачу CL 41 76 будет парализована, независимо от того, понизите ли вы ее до 16 градусов при напряжении, при более низких температурах может произойти повышение экспрессии трансгена, вызывающего паралич.

Однако обратите внимание, что частота паралича будет зависеть от его времени. Частота паралича зависит от конкретного используемого штамма трансгена. Мы создали три бета-штамма А, которые имеют скорость паралича быстрее и медленнее, чем CL 41 76, и поэтому вам необходимо соответствующим образом скорректировать окно оценки для анализа паралича.

Здесь показан график кривой паралича для CL 4 1 76, как без лечения, так и при воздействии кофеина 6,27 миллимоля. Такое лечение приводит к статистически значимой задержке паралича примерно на четыре часа, что мы интерпретируем как признак подавления бета-токсичности. В этой модели в этом эксперименте проверялось воздействие другого соединения, обнаруженного в кофе.

Сюжет типичен для методов лечения, которые не влияют на бета-токсичность. Обратите внимание, что в обоих экспериментах около половины нелеченных популяций CL 4 1 76 парализованы через 24 часа, а паралич завершается к 28 часам. Это типичные временные рамки для паралича контроля.

CL 4 1 7 6 Значительные отклонения от этого времени свидетельствуют об изменении условий окружающей среды или спонтанной делеции трансгенных копий. Дополнительную информацию о штамме CL 4 1 76 см. в прилагаемом протоколе. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о возрасте пластин, стадии популяции червей и способности оценить частоту паралича червей.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как использовать эту систему морского элгана для тщательного анализа токсичности бета-амилоида. Вы должны быть в состоянии обнаружить довольно тонкие эффекты на эту токсичность различных экологических или медикаментозных обработок. На переменные, о которых мы говорили, важно обратить внимание, потому что это позволит вам провести анализ очень воспроизводимо и с постоянной кинетикой паралича.

На самом деле это очень важно, если вы хотите сравнить результаты, полученные в лаборатории в разное время разными людьми, или сравнить свои результаты с результатами других исследователей, использующих эту модельную систему.