Использование карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил Эстер (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов
12 октября 2010 г.
CFSE ковалентно этикетки долгоживущих внутриклеточных молекул флуоресцентного красителя, карбоксифлуоресцеина. Таким образом, когда CFSE меченных клетка делится, его потомства есть половина суммы флуоресценции, который тем самым может быть использован для оценки клеточного деления. В этой статье описываются процедуры обычно используются для маркировки мыши лимфоцитов с CFSE.
Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы пометить лимфоциты внутриклеточным флуоресцентным красителем CFSE, чтобы можно было контролировать деление клеток лимфоцитов с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем смешивания лимфоцитов с CFDA se, которая является диацетильной формой CFSE. Две ацетильные группы позволяют красителю быстро проникать в клетки лимфоцитов.
Эстеразы удаляют ацетильные группы из C-F-D-A-S-E, образуя CFSE форму красителя. Без ацетильных групп CFSE становится флуоресцентным, а также менее проницаемым для мембран, тем самым концентрируя краситель в клетках. Затем аминореактивная боковая цепь AL CFSE КОВАЛЕНТНО СВЯЗЫВАЕТ краситель с внутриклеточными белками, тем самым делая клетки почти постоянно флуоресцентными.
CFSE может быть использован для мониторинга деления лимфоцитов на основе последовательного определения интенсивности флуоресценции дочерних клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как тритиированное включение тимидина, заключается в том, что отдельные клетки можно контролировать на предмет деления клеток. Демонстрировать процедуру будет Бен Куа, научный сотрудник из моей лаборатории по мечению клеток.
Начните со свежевыделенных лимфоцитов из селезенки или лимфатических узлов мышей и добавьте концентрацию от половины до 10 миллионов клеток на миллилитр питательной среды, добавив 5% тепла. Инактивированную сыворотку плода теленка тщательно ресуспендируют клетки и осторожно переносят один миллилитр на дно свежей конической пробирки объемом 10 миллилитров. Аккуратно уложите трубку горизонтально.
Добавьте 110 микролитров PBS в верхнюю часть пробирки в несмачиваемую часть пластика, следя за тем, чтобы она не контактировала с раствором клетки. Добавьте свежий раствор красителя 1,1 микролитра из пяти миллимоляров запаса C-F-D-A-S-E к 110 микролитрам PBS. Быстро закройте пробирку и хорошо переверните и завихрите, чтобы получить быстрое равномерное смешивание растворов, так как краситель становится флуоресцентным и, таким образом, склонным к отбеливанию.
Защитите трубку от света, накрыв трубку алюминиевой фольгой. Инкубируйте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре путем разбавления в 10 объемах 20 градусов Цельсия, PBS, содержащего 5% H-I-F-C-S, осаждения центрифугированием при 300 G в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия и отбраковки надосадочной жидкости. Повторите стирку еще дважды.
Затем клетки могут быть применены к протоколу, представляющему интерес, для индукции клеточного деления. Меченые клетки могут быть использованы как in vitro, так и in vivo. По завершении анализа пролиферации клетки собирают и анализируют с помощью проточной цитометрии.
В этом примере мечение CFSE используется in vitro для измерения того, как Т-клетки генетически модифицированных трансгенных мышей реагируют на дендритные клетки, пульсирующие различными концентрациями антигена. Незакрашенные пики разведения CFSE изображают трансгенные CD восемь положительных Т-клеток, которые делились от одного до трех раз. Можно видеть, что при более высоких концентрациях антигена делится больше Т-клеток.
Метод мечения CFSE также поддается анализам in vivo, таким как эксперименты по адоптивному переносу. В данном случае факс используется для идентификации популяции Т-клеток, представляющих интерес у мышей-реципиентов. Последующий профиль пролиферации CFSE изображает CD восемь положительных Т-клеток, которые делились от одного до шести раз на основе пиков разведения CFSE после их развития.
Эта процедура открыла исследователям и иммунологам путь к изучению пролиферации лимфоцитов во время иммунного ответа.
Обзор
В этой статье описывается процедура маркировки лимфоцитов мыши флуоресцентным красителем CFSE, позволяющая отслеживать деление клеток с помощью проточной цитометрии. Метод позволяет исследователям отслеживать пролиферацию лимфоцитов во время иммунных реакций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Фон
- CFSE - это флуоресцентный краситель, используемый для маркировки внутриклеточных белков.
- Он позволяет оценить деление клеток путем измерения разбавления флуоресценции в дочерних клетках.
- Эта техника предлагает преимущества перед традиционными методами, такими как инкорпорация тритиированного тимидину.
- Маркировка CFSE может применяться как в in vitro, так и в in vivo анализах.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод маркировки CFSE для мониторинга деления лимфоцитов.
- Предоставить подробный протокол для исследователей.
- Показать применение CFSE в изучении ответов Т-клеток на антигены.
Используемые методы
- Изоляция лимфоцитов из селезенки мыши или лимфатических узлов.
- Смешивание лимфоцитов с CFDA SE для облегчения проникновения красителя.
- Инкубация и промывка клеток для удаления избыточного красителя.
- Анализ проточной цитометрии для оценки деления клеток на основе разбавления CFSE.
Основные результаты
- Маркировка CFSE позволяет отслеживать деление Т-клеток в ответ на различные концентрации антигена.
- Проточная цитометрия выявляет различные пики, соответствующие различным уровням деления Т-клеток.
- Метод эффективен как для in vitro, так и для in vivo применений.
- Результаты демонстрируют полезность CFSE в иммунологических исследованиях.
Выводы
- Маркировка CFSE является надежным методом для изучения пролиферации лимфоцитов.
- Эта техника улучшает понимание иммунных реакций.
- Исследователи могут использовать этот метод в различных экспериментальных дизайнах.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
