Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Просмотров живых культур показывают клетки через 1 час после покрытия и дифференцированных нейронов после 2 дней роста бикарбоната основе определенной среде. Нейроны являются электрически возбудимыми и формы синаптических связей.

Меня зовут Диана Дауд, я профессор кафедры биологии развития и клеточной биологии, анатомии и нейробиологии в Калифорнийском университете в Ирвайне. И сегодня я продемонстрирую приготовление первичных культур нейронов из эмбрионов дрозофилы. Это влечет за собой удаление всех клеток из эмбриона дрозофилы, находящегося на средней стадии желудочно-кишечного тракта, и помещение их в клеточную культуру.

И мы используем эти культуры для того, чтобы действительно понять, какие гены и факторы окружающей среды важны для регуляции электрической возбудимости и синаптической передачи между нейронами дрозофилы. Чтобы начать эту процедуру, мы должны собрать эмбрионы дрозофилы. Для этого берем тарелки для сбора яиц, намазываем на них немного дрожжевой пасты.

Это благоприятный субстрат для откладывания яиц взрослыми мухами. Мы помещаем эти пластины в бутылки, содержащие популяцию взрослых мух, обычно от ста до 200 мух. А затем мы даем мухам, взрослым мухам отложить яйца примерно на два-три часа.

Затем мы удаляем пластины для сбора яйцеклеток, и это эмбрионы, которые мы используем для процедуры культивирования. Следующим этапом процедуры является покрытие эмбрионов Dec, что означает, что мы фактически удаляем корион. Мы делаем это, смывая эмбрионы в воронку Бюхнера, на которую у нас есть лист фильтровальной бумаги, чтобы она захватывала эмбрионы.

Мы оставляем их в воронке Бюхнера в 50% растворе отбеливателя. Этот 50% раствор отбеливателя не только растворяет корион, но и служит частью нашей процедуры стерилизации. Мы проводим эту процедуру на самом деле не в капюшоне, а снаружи колпака, поэтому эмбрионы, как только они дехлорируются, мы промываем их в чашке Петри.

На самом деле, когда кориан исчезает, мембрана viel становится довольно липкой, и она будет хорошо прилипать к чашке Петри. Затем вы можете налить на них дистиллированную воду и удалить дистиллированную воду два или три раза, а на самом деле просто сбросить воду, и эмбрионы прилипнут к чашке Петри. Не используйте пластиковую тарелку для культуры тканей.

Они этого не придерживаются. Мы начинаем стерильную часть процедуры с того, что берем чашки Петри эмбрионов и помещаем их в ламинарный проточный колпак. Это чехлы bellco.

Они без покрытия, но они были автоклавированы и их не стирали. Мы обнаруживаем, что они работают не очень хорошо. Когда они промыты, мы обычно достаем четыре покровных листа и кладем их в одну чашку Петри.

Таким образом, мы будем делать четыре культуры эмбрионов в каждой чашке Петри. Итак, чашка Петри в основном готова для того, чтобы мы могли начать культивирование, и я обычно делаю 12 культур, от 12 до 16 культур за раз. Хорошо? Питательная среда, которую мы используем, представляет собой относительно простую среду.

Это основа A-D-M-E-M, и мы добавляем эту жидкую среду раз в две недели, чтобы она оставалась хорошей в течение двух недель в холодильнике. Он был стерилизован. Его пропускают через стерильный фильтр толщиной 0,2 микрона, а затем мы добавляем пять добавок в фильтрующий материал.

Их готовят один раз в два месяца, а затем замораживают в аликвотах, которые добавляют к 10 милам жидкой среды. Поэтому мы просто удаляем содержимое. И последнее, мы просто аккуратно инвертируем этот носитель, чтобы перемешать его, и мы готовы к работе. Хорошо.

Все настроено. У меня есть готовое блюдо для культуры или чашка Петри с четырьмя крышками, готовыми к употреблению. И теперь я собираюсь взять свою тарелку с эмбрионами, и я собираюсь, они сейчас сидят в дистиллированной воде.

Я собираюсь удалить дистиллированную воду, просто стряхнув ее. Вот так я это делаю прямо в мусорное ведро. И теперь я собираюсь залить около двух миллей среды на эти эмбрионы, и теперь они готовы для того, чтобы я мог вставить стеклянную иглу в отдельные эмбрионы и удалить содержимое.

У вас должны быть средства массовой информации снаружи. Очевидно, что если бы там была вода, то у вас был бы осмотический шок. Теперь, чтобы подготовиться к подготовке культур прямо перед тем, как я удалю содержимое эмбриона, я нанес каплю в пять микролитров на покровные листы.

Если оставить его слишком долго, то pH среды меняется. Хорошо, теперь я нанесу каплю пять микролитров на центр каждой из четырех защитных листовок. На самом деле важно, чтобы эти капли оставались как можно более нетронутыми.

Если среда растекается по всему покровному стеклу, то ячейки покрываются на некоторые, очень тонкий слой жидкости затрудняется. Вы хотите, чтобы они поместили клетки в красивую круглую каплю жидкости. Как вы можете видеть, у нас есть четыре красивые круглые капли жидкости, готовые к использованию.

И теперь я возьму одну из пипеток, которую я вытащил, и затем просто прикреплю ее к этой трубке для пипетки. Вы можете использовать любую трубку, которую захотите, но хорошая вещь в этой трубке в том, что она на самом деле поставляется с трубкой VWR, откалиброванной 100 микролитровыми пипетками. И в этих у нас есть, здесь есть маленькая резиновая прокладка.

Я могу вставить ротовую пипетку, я имею в виду стеклянную пипетку, в этот конец пипетки. И затем, когда я всасываю содержимое эмбриона, я не собираюсь подниматься дальше этой области, где он начинает сужаться. Итак, есть огромная область, разделяющая меня с помощью мышиного всасывания здесь и место, где находятся клетки.

Так что нет, нет никаких проблем с загрязнением. Если вы случайно всосете содержимое в эту область, то у вас возникнут огромные проблемы с загрязнением. В наших ламинарных проточных кожухах у нас есть диссекционные микроскопы, которые имеют скопическую основу.

Это позволяет свету проникать снизу эмбриона, и это позволяет нам на самом деле видеть головную борозду и среднюю кишку, а также воображение, которое вы увидите, когда мы посмотрим на настоящие эмбрионы. И вот так мы на самом деле выбираем стадию эмбриона, которая важна для культивирования, чтобы удалить содержимое эмбриона. Мы используем стеклянные пипетки, натягиваем обычный микроэлектродный съемник, который мы используем для изготовления наших пипеток для записи патчей.

Нас на самом деле не волнуют, какие у нас настройки. Мы вытаскиваем довольно тонкие пипетки, потому что мы собираемся отломать пипетку в чашке рядом с эмбрионом того размера, который нам действительно нужен. Затем мы берем эти стеклянные пипетки, вводим их через волшебную мембрану эмбриона и с помощью всасывающей трубки для рта, которая прикреплена к задней части задней части пипетки.

Затем мы извлекаем содержимое всего эмбриона. Затем мы перемещаем его, берем, вынимаем пипетку и перекладываем в другую чашку с крышкой с каплей среды в пять микролитров. И мы выталкиваем содержимое эмбриона в эту каплю в пять микролитров.

Мы несколько раз проверили пипеткой вверх и вниз, чтобы рассеять клетки, а затем оставили эту защитную пластину в чашке примерно на 10 минут, прежде чем залить чашку двумя мельницами среды. Чашки с клетками после того, как они были покрыты, помещаются в инкубатор с 5% содержанием CO2. Это очень важно, потому что среда, которую мы используем, представляет собой бикарбонатную буферизованную среду.

У нас там есть некоторое количество HEP, но их недостаточно для буферизации в воздушной среде. И поэтому вам придется использовать инкубатор с 5% CO2. Тем не менее, это должна быть относительно низкая температура, от 22 до 23 градусов.

Поэтому мы берем стандартный CO2-инкубатор, который использовался бы из культур млекопитающих, и нагреваем его до 37 градусов. Что мы делаем, так это выключаем нагреватель, он находится в нашей лаборатории, и мы можем положить лед на дно инкубатора, и это поддерживает температуру от 21 до 25 градусов. Другой метод, который мы используем, заключается в том, что мы берем один из этих стандартных инкубаторов с подогревом CO2 и помещаем инкубатор в холодную комнату.

Тогда вы действительно сможете довольно эффективно нагреть инкубатор до 23 градусов, если температура окружающей среды холодная комнатная температура. Итак, это два метода, которые мы используем, чтобы иметь стандартного тюленя, млекопитающего тюленя в инкубаторе, чтобы позволить себе выжить. Хорошо, это культура, которая была нанесена час назад с тем же увеличением, которое мы видели сразу после нанесения покрытия через час после покрытия.

Здесь мы видим нейроны, которые дифференцировались около двух дней. В культуре нейробласты делились один или несколько раз, а затем давали начало нейронам, которые расширяют процессы, формирующие обширные перекрывающиеся невротические сети. Здесь у нас есть два клеточных тела, которые находятся друг к другу.

удлиняет процесс в положении «11 часов», а нижний – в положении «пять часов». Это их основные продолжения. И тогда можно заметить, что они образуют более мелкие ветви.

Они очень плотно прилегают к стеклянной подложке, и есть процессы, которые вы можете видеть, которые также происходят из других клеток, которые перекрывают их. И это места потенциальной синаптической связи. Мы бы заплатили одну из этих клеток, и в целом, при таком уровне разработки процесса, они имели бы синаптические функциональные синаптические токи.

Теперь наши клетки растут в культуре через 12 часов после осаждения. У них будут расширенные довольно приятные процессы. По нашей стандартной физиологии мы начинаем делать примерно один-два после культивирования.

И вы можете видеть, что они на самом деле продолжают расти в течение следующих четырех или пяти дней. И мы записывали из клеток до двух недель в культуре, но большинство наших записей происходит от двух до шести дней в культуре с этими культурами, затем мы только что подготовили из эмбрионов дрозофилы на средней стадии желудочно-кишечного тракта, у нас есть сети нейронов, которые общаются в культуре. Мы можем на самом деле посмотреть на свойства возбуждения этих клеток.

Они обладают разнообразными огнеупорными свойствами. Они возбуждаются повторяюще, некоторые клетки возбуждаются повторяюще, другие клетки возбуждаются при рождении, и эти клетки в основном холинергические или ГАМКергические. И мы смотрим на синаптические токи, которые опосредованы ими, никотиновыми, Aach, H-рецепторами и рецепторами ГАМК.