Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации активации BK-каналов при контролируемом напряжении с одновременным контролем состава внутриклеточного раствора. Это достигается путем экспрессии BK-каналов в ооцитах Xenopus, в которые вводят мРНК BK-каналов. Вторым этапом процедуры является подготовка системы перфузии.

Третьим этапом процедуры является формирование гигаомного контакта (giga seal) между мембраной ооцита и патч-пипеткой. Заключительный этап процедуры заключается в вырезании участка мембраны. В конечном итоге результаты, полученные с использованием метода патч-клампа в сочетании с системой перфузии, показывают, что BK-каналы активируются при изменении напряжения и концентрации кальция.

Здравствуйте, меня зовут Джин Чо Ёнг, я работаю в лаборатории доктора Джейми Зус в Вашингтонском университете. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, в том числе касающиеся молекулярных механизмов активации ионных каналов. Итак, приступим.

Первый этап процедуры начинается за несколько дней до проведения метода пэч-кламп и предполагает использование мРНК BK-каналов, транскрибированной in vitro. После сбора ооцитов Xenopus Laevis на пятой или шестой стадии, введите от 0,05 до 50 нг мРНК BK-каналов в ооцит. Используйте наноинъектор Nanoject II с объемом впрыска 2 нл.

Повторите инъекцию с дюжиной ооцитов для каждой мРНК после проведения инъекции. Промойте ооциты дважды, используя раствор ND 96. Затем поместите ооциты в культуральную пластину и инкубируйте их при 18 °C в течение двух или более дней, чтобы ооциты успели экспрессировать BK-канал.

После двух-пяти дней инкубации ооциты должны начать экспрессировать BK-каналы, и таким образом они будут готовы к патч-клампингу. Перед началом работы с ооцитами подготовьте все необходимое для проведения патч-кламппинга, начиная с системы перфузии. В данном примере представлена автоматическая система Automate Valve Link.

Система подачи растворов (profusion system) под давлением азота вытесняет растворы из резервуаров через трубки в наконечник и иглу системы. Поток каждой струи раствора регулируется одним клапаном резервуара и одним электронным клапаном. В данном протоколе один из резервуаров не находится под давлением и служит для сбора отходов, а также в качестве механизма сброса давления.

Перед началом экспериментов можно приготовить перфузионные растворы с различными концентрациями кальция или магния. Добавьте перфузионные растворы в резервуары и промаркируйте каждый из них, указав концентрацию кальция или магния. Для настройки системы перфузии сначала подключите трубки к перфузионному карандашу.

Затем включите электронный контроллер клапанов и откройте электронные клапаны, чтобы убедиться в отсутствии засоров и пузырьков воздуха в трубках и перфузионном карандаше. Прокачайте деионизированную воду через каждую трубку с помощью шприца, заполненного деионизированной водой. После этого подсоедините трубки к резервуарам с растворами и откройте клапан газового баллона для подачи азота под давлением.

Откройте один клапан резервуара, чтобы заполнить трубку одним из резервуарных растворов. При необходимости нажмите на клапан резервуара, чтобы удалить пузырьки из раствора. После заполнения трубки раствором закройте клапан резервуара, заполните наконечник для перфузии водой и прикрутите его к перфузионному карандашу.

Следите за тем, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха. При подключении наконечника закрепите перфузионный карандаш на платформе ванны с помощью модельного пластилина, убедившись, что наконечник для перфузии находится в пространстве ванны. На этом установка перфузионной системы завершена.

На этом этапе добавьте в ванночку деионизированную воду. Убедитесь, что кончик системы перфузии погружен в воду. Проверьте, что каждый перфузионный раствор правильно поступает из кончика системы перфузии.

Закройте электронный клапан, подключенный к трубке сборника отходов, и откройте клапан для одного из перфузионных растворов. Под микроскопом пронаблюдайте за струей перфузионной жидкости, выходящей из кончика перфузионного наконечника. Закройте клапан этого перфузионного раствора и откройте клапан сборника отходов.

Струя перфузии должна почти исчезнуть. Повторите этот тест для каждого из перфузионных растворов. После того как вы убедитесь, что все перфузионные растворы протекают правильно, замените деионизированную воду в ванночке на необходимый раствор для ванночки.

Теперь пришло время подготовить регистрирующее оборудование. Перед каждым сеансом локального прижатия мембраны (patch clamp) необходимо заново покрыть серебряный регистрирующий электрод хлоридом серебра. Сначала извлеките проволоку электрода из держателя пипетки и погрузите ее кончик в флакон со свежим отбеливателем минимум на 15 минут.

В результате этого на проволоке осаждается слой хлорида серебра. Промойте проволоку электрода деионизированной водой и промокните насухо. Затем установите электрод из хлорида серебра обратно в держатель пипетки.

Теперь включите компьютер. Подключите аппаратный ключ к принтерному порту компьютера. Аппаратный ключ должен быть подключен для работы с программным обеспечением для сбора данных HEA pulse.

Включите усилитель и запустите программное обеспечение для сбора данных. Импульс HEA. Загрузите файл протокола и настройте параметры конфигурации, такие как масштаб стимула.

Целью настройки параметров конфигурации является обеспечение точного соответствия тестового потенциала командному потенциалу. Теперь мы готовы к подготовке ооцитов. Извлеките ооциты из инкубатора.

Погрузите ооцит в раствор для снятия оболочки на 5–10 минут. Раствор для снятия оболочки отделяет вителлиновую мембрану от плазматической мембраны, что позволяет удалить вителлиновую мембрану. Через 5–10 минут аккуратно снимите вителлиновую мембрану с ооцита.

Используйте два пинцета. Сайт divi OC крайне хрупок, поэтому его следует перемещать по возможности меньше. Чтобы избежать воздействия воздуха или пузырьков на ооцит Devi, используйте стеклянную пипетку, заполненную достаточным количеством раствора, для переноса ооцита в ванночку.

Каналы на мембране ооцита теперь открыты и готовы к использованию патч-пипетки. Изготовьте патч-пипетку, вставив стеклянную капиллярную трубку в микропипеттовытяживатель. Осмотрите пипетки под микроскопом, чтобы определить форму кончика и диаметр отверстия.

Диаметр отверстия должен составлять от 2 до 4 мкм, чтобы снизить емкостный ток при регистрации; для обеспечения гладкости кончика покройте его воском, а затем оплавьте. Отполируйте кончик под микроскопом. Заполните кончик пипетки, погрузив его в раствор для пипеток и потянув поршень.

Это увлажняет кончик пипетки. Затем с помощью шприца заполните пипетку раствором для пипетки на одну треть. После этого поместите пипетку в держатель с установленным внутри хлоридсеребряным электродом.

Убедитесь, что проволочный электрод контактирует с раствором в пипетке. Следующий этап — вырезание патча типа «inside-out» (вывернутого наизнанку) из подготовленного ооцита. Сначала найдите под микроскопом четкий край ооцита.

С помощью манипулятора подведите патч-пипетку к ооциту, убедившись, что она погружена в жидкость. Измерьте последовательное сопротивление пипетки в банном растворе. Идеальное последовательное сопротивление патч-пипетки при заполнении ее раствором для пипетки и погружении в банный раствор составляет от 1 до 1.5 МОм.

Теперь медленно прижмите пипетку к ооциту до тех пор, пока сопротивление не увеличится примерно вдвое. Сформируйте гигаомический контакт (giga ohm seal), создав осторожный вакуум с помощью рта через аспирационную трубку, подключенную к держателю пипетки. После подтверждения формирования гигаомного контакта стабилизируйте патч, поддерживая потенциал минус 30 mV в течение нескольких минут.

Для получения патча «изнутри-наружу» вырежьте его, быстро продвинув пипетку глубже в область OO, а затем осторожно вытянув её. Теперь патч «изнутри-наружу» готов к методу локальной фиксации потенциала (patch clamp). Переместите пипетку с закрепленным патчем «изнутри-наружу» на расстояние примерно 100 microns от отверстия перфузионного наконечника.

Закройте электронный клапан сбора отходов и откройте клапан резервуара с необходимым перфузионным раствором. Начните запись токов через патч. Изменяйте напряжение и перфузионные растворы по мере необходимости.

После завершения записи промойте капилляры и кончик системы перфузии деионизированной водой, чтобы предотвратить засорение. Полученные здесь записи методом патч-клампа показывают, что BK-каналы дикого типа на патче мембраны ооцита реагируют как на напряжение, так и на кальций. На данном рисунке представлена запись патча при номинальном нулевом содержании кальция в перфузионном растворе.

Прямоугольные волны над кривыми тока указывают на напряжение, подаваемое на патч. Было подано четыре значения напряжения в диапазоне от 50 millivolts до 200 millivolts с шагом 50 millivolts. Максимальный ток, примерно два nano amps, был получен при максимальном напряжении 200 millivolts.

Данное увеличение амплитуды тока при повышении напряжения указывало на то, что вероятность открытия BK-каналов возрастала с увеличением напряжения. На этом рисунке показан ответ патча в конфигурации «изнутри-наружу» на различные значения напряжения. Ступенчатое изменение напряжения применялось при концентрации кальция 1 µM в перфузионном растворе.

Как видно на предыдущем рисунке, при подаче ступеньки напряжения 200 millivolt верхний отклик увеличился примерно до three nano amps в присутствии кальция в растворе Perfu eight по сравнению с two nano amps при отсутствии кальция. Это указывает на то, что вероятность открытия BK-каналов увеличилась в присутствии кальция. Таким образом, данная процедура пэтч-клампинга показала, что BK-каналы зависят от напряжения и концентрации кальция.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как регистрировать активацию железных каналов с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) в сочетании с системой подачи топлива. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.