Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

Общая цель этой процедуры заключается в регистрации активации канала BK при контролируемом напряжении, а также в управлении внутриклеточным раствором. Это достигается путем первичной экспрессии каналов BK в цитах Xenopus путем введения в них мРНК канала BK. Вторым этапом процедуры является подготовка перфузионной системы.

Третьим этапом процедуры является формирование гига-уплотнения между мембраной ооцита и патч-пипеткой. Заключительным этапом процедуры является иссечение мембранного пластыря. В конечном счете, результаты, полученные с помощью технологии патч-зажимов в сочетании с системой Profusion, показывают, что каналы BK активируются при изменении напряжения и концентрации кальция.

Здравствуйте, я Джин Чо Янг из лаборатории доктора Джейми Зуса в Вашингтонском университете. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, в том числе на вопросы, касающиеся молекулярного механизма активации ионных каналов. Итак, приступим.

Первый этап процедуры начинается за пару дней до зажима пластыря и использует мРНК канала BK, которая была транскрибирована in vitro. После сбора цитов Xenopus Lavu на пятой-шестой стадиях введите от 0,05 до 50 нанограммов мРНК канала BK в цит. С помощью nano inject два автоматических нанолитровых инжектора.

Повторите инъекцию на дюжине ооцитов для каждой мРНК после инъекции. Дважды промойте ооциты раствором ND 96. Затем поместите ооциты в культуральный планшет и инкубируйте их при температуре 18 градусов Цельсия в течение двух или более дней, чтобы дать ооцитам время для экспрессии канала BK.

После двух-пяти дней инкубации ооциты должны экспрессировать каналы BK и, таким образом, уже готовы к зажиму пластыря. Прежде чем работать с ооцитами, настройте все остальное, что вам потребуется для зажима пластыря, начиная с системы перфузии. Показанная здесь система представляет собой соединительную муфту автоматического клапана.

16 Система Profusion Азот под давлением выталкивает Profusion растворы из резервуаров для раствора через трубки Profusion и в карандаш и наконечник Profusion. Расход каждого потока обильного раствора контролируется одним клапаном резервуара и одним электронным клапаном. В этом протоколе один из резервуаров не находится под давлением и функционирует как сборщик отходов, а также как механизм сброса давления.

Перед началом экспериментов могут быть приготовлены перфузионные растворы различной концентрации кальция или магния. Добавьте растворы для перфузии в резервуары и пометьте каждый из них, указав концентрацию кальция или магния. Чтобы сначала настроить систему profusion, подсоедините трубки к карандашу profusion.

Затем включите электронный контроллер клапанов и откройте электронные клапаны, чтобы убедиться, что трубки и карандаш для обильности не имеют засоров и пузырьков воздуха. Протолкните деионизированную воду через каждую трубку с помощью шприца, наполненного деионизированной водой. В этот момент подсоедините трубки к резервуарам с раствором и откройте клапан газового баллона для подачи давления на азот.

Откройте один клапан резервуара, чтобы заполнить трубку одним из растворов резервуара. При необходимости нажмите на клапан резервуара, чтобы удалить пузырьки в растворе. Закройте клапан резервуара после того, как трубка будет заполнена раствором, заполните перфузионный наконечник водой и накрутите его на перфузионный карандаш.

Будьте осторожны, чтобы не зацепить пузыри. При подключении наконечника зафиксируйте перфузионный карандаш к ступице ванны с помощью пластилина, убедитесь, что наконечник для обильности находится в пространстве ванны. Теперь система изобилия настроена.

На этом этапе добавьте в ванну деионизированную воду. Убедитесь, что наконечник для обильности погружен в воду. Убедитесь, что каждый перфузионный раствор правильно выходит из перфузионного наконечника.

Закройте электронный клапан, соединенный с трубкой коллектора отходов, и откройте клапан для одного из растворов для обильного размещения. Под микроскопом наблюдайте за струей обильной жидкости, выходящей из перфузионного наконечника. Закройте клапан для этого обильного раствора и откройте клапан для сборщика отходов.

Обильная струя должна почти исчезнуть. Повторите тот же тест для каждого из перфузионных растворов. Убедившись, что все перфузионные растворы текут правильно, замените деионизированную воду в ванне желаемым раствором для ванны.

Теперь пришло время настроить записывающее устройство. Вы должны повторно покрывать серебряный записывающий электрод хлоридом серебра перед каждым сеансом зажима патча. Сначала извлеките электродный провод из держателя пипетки и погрузите половину кончика электродного провода во флакон со свежим отбеливателем не менее чем на 15 минут.

При этом на проволоке наносится слой хлорида серебра. Промойте электродную проволоку деионизированной водой и промокните насухо. Затем установите электрод из хлорида серебра обратно в держатель пипетки.

Теперь включите компьютер. Подключите аппаратный ключ к порту принтера компьютера. Аппаратный ключ должен быть вставлен в розетку, чтобы вы могли использовать программное обеспечение для сбора данных, которым является HEA pulse.

Включите усилитель и запустите программное обеспечение для сбора данных. Пульс HEA. Загрузите файл протокола и настройте параметры конфигурации, такие как шкала стимулов.

Целью корректировки параметров конфигурации является обеспечение того, чтобы тестовый потенциал был точно равен командному потенциалу. Теперь мы готовы к подготовке ооцитов. Извлеките ооциты из инкубатора.

Погрузите ооцит в стриппинговый раствор на пять-10 минут. Стриппинговый раствор отделяет виельную мембрану от плазматической мембраны, что позволяет отделить вительную мембрану. Через пять-10 минут аккуратно снимите вительную оболочку с ооцита.

С помощью двух щипцов. Сайт divi OC чрезвычайно хрупок и поэтому его следует перемещать как можно реже. Чтобы предотвратить попадание воздуха или пузырьков в ооцит Деви, используйте стеклянную пипетку, наполненную достаточным количеством раствора для переноса ооцита в ванну.

Теперь каналы на мембране ооцита открыты и готовы к проведению патч-пипетки. Вытяните патч-пипетку, вставив стеклянную капиллярную трубку в съемник микропипетки. Понаблюдайте за пипетками под микроскопом, чтобы определить форму наконечника и диаметр отверстия.

Диаметр отверстия должен составлять от двух до четырех микрометров, чтобы уменьшить емкостный ток во время записи, а для обеспечения гладкого наконечника покройте наконечник воском, а затем обогнете. Отполируйте его под микроскопом. Заполните наконечник пипетки, поместив кончик пипетки внутрь раствора для пипетки и втянув поршень.

При этом кончик пипетки смачивается. Далее заполните пипетку на треть раствором пипетки с помощью шприца. Затем поместите пипетку в держатель пипетки с электродом из серебра и хлорида серебра внутри.

Убедитесь, что проволочный электрод находится в контакте с раствором пипетки. Следующим этапом является вырезание из подготовленной яйцеклетки заплатки наизнанку. Во-первых, найдите четкий край ооцита под микроскопом.

С помощью манипулятора переместите патч-пипетку близко к ооциту, убедившись, что она погружена в воду. В растворе ванны запишите последовательное сопротивление пипетки. Идеальное последовательное сопротивление патч-пипетки составляет от одного до 1,5 миллиОм при заполнении раствором пипетки и погружении в раствор для ванны.

Теперь медленно прижимайте пипетку к ооциту, пока ее сопротивление не увеличится примерно в два раза. Получите гигаомное уплотнение, применяя мягкое всасывание ртом через всасывающую трубку, подключенную к держателю пипетки. Убедившись, что образовалась гига-печать, стабилизируйте пластырь, удерживая его при температуре минус 30 милливольт в течение пары минут.

Чтобы получить вывернутый наизнанку пластырь, вырежьте пластырь, быстро протолкнув пипетку дальше в место ОО, а затем осторожно вытащив его. Теперь наизнанку патч готов к фиксации патча. Переместите пипетку, удерживая пластырь наизнанку, примерно на 100 микрон от отверстия перфузионного наконечника.

Закройте электронный клапан для сбора отходов и откройте клапан резервуара для получения желаемого раствора для обильного использования. Начните запись токов по всему патчу. Изменяйте напряжение и производительность растворов по желанию.

Когда вы закончите запись, очистите трубки от карандаша и наконечника, протолкнув деионизированную воду, чтобы избежать засорения. Полученные здесь записи зажима пластыря показывают, что каналы BK дикого типа на мембранном участке ооцитов реагируют как на напряжение, так и на кальций. На этом рисунке показана запись патча с номинальным нулевым содержанием кальция в перфузионном растворе.

Квадратные волны над проводниками тока указывают на напряжение, подаваемое на патч. Четыре напряжения подавались в диапазоне от 50 до 200 милливольт с шагом 50 милливольт. Максимальный ток, примерно два наноампера, был получен при максимальном напряжении 200 милливольт.

Это увеличение амплитуды тока с увеличением напряжения указывало на то, что вероятность разомкнутости каналов БК увеличивалась с напряжением. На этом рисунке показана реакция вывернутого наизнанку патча на различные напряжения. Когда в перфузионном растворе был один микромолярный кальций, применялись ступени напряжения.

Как и на следующем рисунке, отклик на шаг напряжения 200 милливольт, максимальный отклик увеличивался примерно до трех наноампер, когда в восьмерке Perfu был кальций, по сравнению с двумя наноамперами без кальция. Это свидетельствует о том, что вероятность открытия БК-каналов увеличивается в присутствии кальция. Таким образом, эта процедура зажима пластыря показала, что каналы BK зависят от напряжения и кальция.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как записывать активацию Iron Channel с помощью техники патч-хомута в сочетании с профессиональной системой заправки. Сейчас. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.