Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации активации BK-каналов при контролируемом напряжении с одновременным контролем состава внутриклеточного раствора. Это достигается путем экспрессии BK-каналов в ооцитах Xenopus посредством инъекции мРНК BK-каналов. Вторым этапом процедуры является подготовка системы перфузии.

Третьим этапом процедуры является создание гигаомажного контакта (giga seal) между мембраной ооцита и патч-пипеткой. Заключительным этапом процедуры является вырезание фрагмента мембраны. В конечном итоге результаты, полученные с использованием метода патч-кламп в сочетании с системой перфузии, показывают, что BK-каналы активируются изменениями напряжения и концентрации кальция.

Здравствуйте, я Джин Чо Ёнг из лаборатории доктора Джейми Зус в Вашингтонском университете. Данный метод поможет ответить на ключевые вопросы в области нейронаук, включая вопросы, касающиеся молекулярного механизма активации ионных каналов. Итак, приступим.

Первый этап процедуры начинается за несколько дней до проведения локальной фиксации потенциала (patch clamp) и предполагает использование мРНК BK-каналов, транскрибированных in vitro. После сбора ооцитов Xenopus laevis на пятой или шестой стадии развития введите от 0,05 до 50 нг мРНК BK-каналов в ооцит. Для этого используйте автоматический нанолитровый инжектор Nanoject II.

Повторите инъекцию для дюжины ооцитов для каждой мРНК после проведения инъекции. Дважды промойте ооциты раствором ND 96. Затем поместите ооциты в культуральную планшетку и инкубируйте их при 18 °C в течение двух или более дней, чтобы обеспечить достаточное время для экспрессии BK-каналов в ооцитах.

После двух-пяти дней инкубации ооциты должны начать экспрессировать BK-каналы и стать пригодными для патч-клампинга. Перед началом работы с ооцитами подготовьте все необходимое оборудование для патч-клампинга, начиная с системы перфузии. Здесь представлена система automate valve link.

Система профузии под давлением азота вытесняет профузионные растворы из резервуаров через профузионные трубки в профузионный карандаш и наконечник. Поток каждого потока профузионного раствора регулируется одним клапаном резервуара и одним электронным клапаном. В данном протоколе один из резервуаров не находится под давлением и выполняет функцию сборника отходов, а также механизма сброса давления.

Перед началом экспериментов можно приготовить перфузионные растворы с различной концентрацией кальция или магния. Добавьте перфузионные растворы в резервуары и промаркируйте каждый из них, указав концентрацию кальция или магния. Для настройки системы перфузии сначала подсоедините трубки к перфузионному карандашу.

Затем включите электронный контроллер клапанов и откройте электронные клапаны, чтобы убедиться в отсутствии засоров и пузырьков воздуха в трубках и перфузионном карандаше. Пропустите деионизированную воду через каждую трубку, используя шприц с деионизированной водой. После этого подключите трубки к резервуарам с раствором и откройте клапан газового баллона для подачи азота под давлением.

Откройте один клапан резервуара, чтобы заполнить трубку одним из резервуарных растворов. При необходимости нажмите на клапан резервуара, чтобы удалить пузырьки воздуха из раствора. Закройте клапан резервуара после заполнения трубки раствором, заполните наконечник для перфузии водой и прикрутите его к перфузионному карандашу.

Следите за тем, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха. При подключении наконечника закрепите перфузионный карандаш на платформе ванны с помощью модерирующей глины, убедившись, что перфузионный наконечник находится внутри пространства ванны. Теперь система перфузии настроена.

На данном этапе добавьте в ванночку деионизированную воду. Убедитесь, что кончик перфузионного наконечника погружен в воду. Проверьте, что каждый перфузионный раствор правильно поступает из перфузионного наконечника.

Закройте электронный клапан, подключенный к трубке сборника отходов, и откройте клапан для одного из перфузионных растворов. Под микроскопом пронаблюдайте за струей перфузионной жидкости, выходящей из наконечника для перфузии. Закройте клапан этого перфузионного раствора и откройте клапан сборника отходов.

Струя перфузии должна почти исчезнуть. Повторите этот тест для каждого из перфузионных растворов. После того как вы убедитесь, что все перфузионные растворы текут правильно, замените деионизированную воду в ванне на необходимый раствор для ванны.

Теперь перейдем к подготовке записывающей аппаратуры. Перед каждым сеансом патч-кламп записи необходимо повторно покрывать серебряный записывающий электрод хлоридом серебра. Для начала извлеките электродный провод из держателя пипетки и погрузите его кончик в флакон со свежим отбеливателем минимум на 15 минут.

В результате этого на проволоке осаждается слой хлорида серебра. Промойте проволоку электрода деионизированной водой и промокните насухо. Затем установите электрод из хлорида серебра обратно в держатель пипетки.

Теперь включите компьютер. Подключите аппаратный ключ к принтерному порту вашего компьютера. Аппаратный ключ должен быть подключен для использования программного обеспечения для сбора данных HEA pulse.

Включите усилитель и запустите программное обеспечение для сбора данных. HEA pulse. Загрузите файл протокола и настройте параметры конфигурации, такие как масштаб стимула.

Цель настройки конфигурации заключается в том, чтобы обеспечить точное соответствие тестового потенциала заданному потенциалу. Теперь можно приступить к подготовке ооцитов. Достаньте ооциты из инкубатора.

Погрузите ооцит в раствор для снятия оболочки на 5–10 минут. Раствор для снятия оболочки отделяет вителлярную мембрану от плазматической мембраны, что позволяет удалить вителлярную мембрану. Через 5–10 минут осторожно снимите вителлярную мембрану с ооцита.

Используйте два пинцета. Ооцит девидуального типа крайне хрупок, поэтому его следует перемещать минимально необходимое количество раз. Чтобы не допустить контакта ооцита с воздухом или пузырьками, используйте стеклянную пипетку, заполненную достаточным количеством раствора, для переноса ооцита в ванночку.

Каналы на мембране ооцита теперь открыты и готовы к установке патч-пипетки. Изготовьте патч-пипетку, вставив стеклянную капиллярную трубку в микропипетовытягиватель. Осмотрите пипетки под микроскопом, чтобы определить форму кончика и диаметр отверстия.

Диаметр отверстия должен составлять от двух до четырех микрометров для снижения емкостного тока во время регистрации; чтобы кончик был гладким, покройте его воском, а затем оплавьте. Отполируйте его под микроскопом. Заполните кончик пипетки, погрузив его в раствор для пипеток и потянув поршень на себя.

Это увлажняет кончик пипетки. Затем с помощью шприца заполните пипетку раствором для пипетки на одну треть. После этого поместите пипетку в держатель с электродом из серебра и хлорида серебра внутри.

Убедитесь, что проволочный электрод контактирует с раствором в пипетке. Следующий шаг — вырезание патча типа «inside-out» из подготовленного ооцита. Сначала найдите под микроскопом четкий край ооцита.

С помощью манипулятора подведите патч-пипетку к ооциту, убедившись, что она погружена в раствор. В банном растворе измерьте последовательное сопротивление пипетки. Идеальное последовательное сопротивление патч-пипетки при заполнении ее раствором для пипеток и погружении в банный раствор составляет от 1 до 1,5 МОм.

Теперь медленно прижимайте пипетку к ооциту до тех пор, пока сопротивление не увеличится примерно в два раза. Сформируйте гигаомный контакт, осторожно создав вакуум с помощью рта через аспирационную трубку, подключенную к держателю пипетки. После подтверждения образования гигаомного контакта стабилизируйте патч, поддерживая потенциал минус 30 millivolts в течение нескольких минут.

Чтобы получить патч «вывернутый наизнанку» (inside out patch), вырежьте его, быстро продвинув пипетку глубже в место создания отверстия (OO site), а затем осторожно вытянув её наружу. Теперь патч «вывернутый наизнанку» готов к локальной фиксации мембраны (patch clamping). Переместите пипетку с зафиксированным патчем на расстояние примерно 100 microns от отверстия перфузионного наконечника.

Закройте электронный клапан сбора отходов и откройте клапан резервуара с необходимым раствором для перфузии. Начните запись токов через патч. Изменяйте напряжение и растворы для перфузии по мере необходимости.

По завершении записи очистите трубки системы перфузии и наконечник, пропустив через них деионизированную воду, чтобы предотвратить засорение. Записи патч-клампа, полученные в данном случае, показывают, что каналы BK дикого типа на патче мембраны ооцита реагируют как на напряжение, так и на кальций. На данном рисунке представлена запись патча при номинальном нулевом содержании кальция в перфузионном растворе.

Прямоугольные волны над кривыми тока указывают на напряжение, прикладываемое к патчу. Были приложены четыре значения напряжения в диапазоне от 50 millivolts до 200 millivolts с шагом 50 millivolts. Максимальный ток, приблизительно два nano amps, был получен при максимальном напряжении 200 millivolts.

Это увеличение амплитуды тока при повышении напряжения указывало на то, что вероятность открытия BK-каналов возрастала с увеличением напряжения. На данном рисунке показан ответ патча в конфигурации «изнутри-наружу» на различные значения напряжения. Ступени напряжения подавались при концентрации кальция 1 µM в перфузионном растворе.

Как и на предыдущем рисунке, при подаче ступенчатого напряжения 200 millivolt верхний отклик увеличился примерно до three nano amps в присутствии кальция в Perfu eight по сравнению с two nano amps в отсутствие кальция. Это указывает на то, что вероятность открытия BK-каналов увеличилась в присутствии кальция. Таким образом, данная процедура локального прижимного закрепления показала, что BK-каналы зависят от напряжения и концентрации кальция.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как регистрировать активацию железных каналов с помощью метода локальной фиксации мембраны (patch clamp) в сочетании с системой подачи топлива. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.