Количественная Синапсы: Иммуноцитохимическая основе Пробирной количественно Synapse Количество

Одной из важнейших задач нейробиологии является понимание молекулярных механизмов, управляющих ранними этапами формирования синапсов. В связи с этим возникла необходимость в разработке объективных подходов для количественной оценки изменений синаптической связности. Для определения количества синапсов в различных экспериментальных образцах культивируемые нейроны или криосрезы тканей мозга окрашивают селективными пре- и постсинаптическими маркерами для маркирования точек синаптического контакта между нейронами.

Затем клетки или ткани визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа, получая 8-битные изображения для каждого из каналов, соответствующих двум иммуногистохимическим маркерам. Изображения анализируют в программе ImageJ 1.29 с использованием плагина Puncta Analyzer. Для определения степени колокализации пре- и постсинаптических маркеров точки колокализации используют для подсчета количества синапсов в препарате.

Основным преимуществом описанной здесь методики по сравнению с существующими методами, такими как электронная микроскопия, является то, что данный анализ синапсов позволяет проводить количественную оценку и анализ числа синапсов с гораздо более высокой пропускной способностью. Основное значение данной методики заключается в possibilities диагностики и терапии клинических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, эпилепсия или аутизм, при которых нарушения синаптической связности считаются основой лежащей в основе патологии. Эту методику можно использовать для поиска способов вмешательства, способных уменьшить или облегчить дефицит способности пораженных нейронов формировать синапсы друг с другом.

Хотя данный метод полезен для изучения развития мозга, его также можно применять к другим модельным организмам или системам органов, если необходимо изучить или количественно оценить количество межклеточных контактов, при условии возможности селективного мечения каждой противоположной стороны каждого участка контакта. Подготовьте нейрональные культуры, высевая очищенные ганглионарные клетки сетчатки крысы, полученные от животных на стадии P5–7, на стеклянные покровные стекла, покрытые поли-D-лизином. В 24-луночном планшете клеткам дают расти при 37 °C в течение трех–пяти дней перед трансфекцией.

После трансфекции инкубируйте клетки еще семь-восемь дней, чтобы синапсы успели развиться, когда высеянные клетки достаточно созреют. Удалите культуральную среду из лунок и добавьте в каждую лунку 500 µL предварительно нагретого 4% параформальдегида для фиксации в течение семи минут. После фиксации при комнатной температуре трижды промойте клетки фосфатно-солевым буферным раствором.

Важно следить за тем, чтобы клетки в лунках ни в коем случае не пересыхали. Сразу после удаления буфера из лунки его следует заменить следующим буфером. Приготовьте блокирующий буфер, содержащий 50% нормальной сыворотки козы и 0,2% Triton X 100.

После удаления PBS из каждой лунки добавьте в каждую из них 200 µL блокирующего буфера и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер и промойте лунки трижды. Используя PBS, приготовьте разведение первичных антител в растворе, состоящем из 90% антительного буфера и 10% NGS, содержащем выбранную пару пре- и постсинаптических антител.

Здесь используются кроличьи антитела к синапсину (пресинаптический маркер) и мышиные антитела к Homer (постсинаптический маркер). Центрифугируйте разведение первичных антител в течение пяти минут на максимальной скорости в настольной центрифуге, чтобы удалить любые осадки антител, затем добавьте по 200 µL раствора первичных антител в каждую лунку. Поместите планшет в увлажненный контейнер, чтобы предотвратить высыхание раствора первичных антител.

После инкубации с первичными антителами выдержите образцы в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте каждую лунку три раза. Добавьте 200 µL соответствующих вторичных антител, разведенных 1:1000 в подготовленном буфере для антител, содержащем 10% NGS, с использованием PBS.

Как и ранее, поместите чашку в увлажненную камеру и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре в темноте после инкубации со вторичными антителами. Промойте каждую лунку три-четыре раза раствором PBS. Нанесите каплю среды для заключения Vector Shield с DPI на предметное стекло.

Затем переверните покровное стекло с клетками на каплю для закрепления препарата. В завершение нанесите бесцветный лак для ногтей по краям покровного стекла. Будьте осторожны, чтобы не сдвинуть и не сместить покровные стекла во время нанесения.

Поскольку это может привести к повреждению клеток, дайте предметным стеклам высохнуть в течение не менее 30 минут в сухом темном месте. Визуализация выполняется с использованием флуоресцентного микроскопа ZEISS Axio Imager, оснащенного соответствующими наборами фильтров и иммерсионным масляным объективом с увеличением 63x. Поместите на предметный столик микроскопа стекло с нетрансфецированными клетками.

Используя набор фильтров DPI для визуализации ядер клеток, выберите клетки, которые находятся на расстоянии не менее двух клеточных диаметров от ближайших соседних клеток. Использование DPI на этом этапе поможет избежать систематической ошибки и обеспечит случайность выбора клеток. Для каждой выбранной клетки получите 8-битные изображения с помощью соответствующих наборов фильтров, в данном случае GFP и Texas Red.

На совмещенном псевдоцветном изображении пресинаптические и постсинаптические маркеры должны быть окрашены в красный и зеленый цвета соответственно. Затем поместите на предметный столик микроскопа препарат с трансфицированными клетками. В данном случае клетки были трансфицированы экспрессионным вектором TD tomato.

Используйте этот маркер для выбора клеток, как и прежде. Для каждой выбранной клетки получите восемь изображений ямок, используя соответствующие наборы фильтров, в данном случае: GFP, Texas Red и Sci five. На наложенном псевдоцветном изображении постсинаптические маркеры должны быть представлены красным, зеленым и синим цветами.

В данном случае программа анализа пунктирных структур (puncture analyzer) используется для количественного определения совместно локализованных синаптических пунктиров. Плагин Puncta analyzer был написан Бэрри Уоком и доступен по запросу в ImageJ 1.26. Откройте одно из полученных изображений.

Используйте инструмент кругового выделения, чтобы выбрать область радиусом примерно в один диаметр клетки вокруг интересующего SOR. После выбора области интереса перейдите в меню plugins и выберите puncture analyzer; в появившемся окне параметров анализа выберите Red Channel и Green Channel. Сначала выполните subtract background и укажите файл результатов (set results file).

Нажмите «ОК». Затем укажите папку для сохранения результатов. В появившемся окне эти результаты можно экспортировать в Excel для дальнейшего анализа.

Затем убедитесь, что выбран радиус скользящего шарика (rolling ball radius), равный 50, и снимите флажок с опции белого фона (white background). Эта модификация не является обязательной, но часто предпочтительна для пользователей приложения. Для облегчения визуализации нажмите «ОК».

Рядом появится новое окно с маской, соответствующей изображению красного канала. Отрегулируйте порог так, чтобы красная маска максимально точно соответствовала максимально возможному количеству отдельных проколов. Нажмите «Готово», стараясь не допустить появления избыточного шума.

Установите минимальный размер пункта в четыре пикселя. Больше ничего не изменяйте. Нажмите «ОК».

Повторите предыдущий шаг, на этот раз для зеленого канала. После выполнения этой операции для зеленого канала плагин предоставит данные количественного анализа пунктат в каждом канале по отдельности, а также данные о колокализованных пунктах между двумя каналами. Описанный здесь метод анализа синапсов можно применять к криосрезам головного мозга и любым другим тканям нервной системы, таким как спинной мозг или сетчатка.

При наличии подходящей пары пре- и постсинаптических маркеров начните со сбора тканей мозга мыши, подвергнутой эвтаназии путем обескровливания и перфузии с PBS. Поместите весь мозг в 4% паральдегид в PBS при температуре четыре градуса Цельсия на ночь, чтобы продолжить работу на следующий день.

Трижды промойте мозг в PBS. Проведите криопротекцию мозга, поместив его в 30% раствор сахарозы в PBS.

Ткань изначально будет плавать; ее следует выдерживать при температуре 4 °C до тех пор, пока она не осядет на дно. На этом этапе криопротекция считается завершенной. Затем в растворе из 20% sucrose, OCT и PBS в соотношении два к одному залейте мозг в компаунд в нужном для последующего секционирования положении.

Например, сагиттальный или корональный. Затем поместите плоскую металлическую поверхность на контейнер с сухим льдом. Поместите на нее включенный в блок мозг для заморозки; после полной заморозки перенесите мозг в пакет для заморозки и храните при температуре -80 °C до одного года до момента проведения секционирования.

С помощью криостата выполните криосрезы ткани толщиной от 12 до 16 микрон и закрепите их на предметных стеклах. Затем высушите стекла, поместив их в термостат при температуре 37 °C. После этого трижды промойте их раствором PBS, чтобы удалить остатки OCT.

С помощью парафинового карандаша создается гидрофобный барьер по периметру предметного стекла, после чего на стекло наносят блокирующий буфер, который удерживается парафиновой границей. Для блокирования поместите стекла в 20% нормальную сыворотку козы в PBS на один час при комнатной температуре, затем перенесите срезы в раствор первичных антител, разведенных в PBS с 0,3% Triton и 10% нормальной сыворотки козы.

В данном случае кроличьи антитела к PSD 95 используются для маркировки глутаматергических постсинаптических компартментов, а антитела морской свинки к vGlu2 — для маркировки глутаматергических пресинаптических терминалей. Поместите предметные стекла при температуре 4 °C и инкубируйте от 36 до 60 часов. После инкубации удалите первичные антитела, трижды погрузив стекла в PBS на 15 минут каждое.

После этого этапа убедитесь, что стекла защищены от прямого света. Нанесите вторичные антитела, разведенные 1:200 в PBS с 0,3% Triton и 10% нормальной козьей сыворотки. В данном случае используются козьи антитела к антигенам морских свинок.

Используют Alexa 488 и козьи антитела против кроличьих, а также Alexa 594. Инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре в темноте.

Промойте предметные стекла, четырежды погружая их в PBS на 15 минут каждое перед закреплением. С помощью аппликатора нанесите небольшие капли среды для заключения Vector Shield и накройте стекла покровными стеклами. Нанесите лак для ногтей, чтобы предотвратить смещение покровных стекол.

Визуализацию срезов ткани следует проводить с помощью конфокального микроскопа с соответствующими лазерами, используя объектив с масляным погружением с увеличением 63x для каждого изображения среза; при этом следует получать серийные оптические срезы с интервалом 0,33 micron на общую глубину 5 micron, что в сумме составит 15 оптических срезов. Необходимо визуализировать не менее трех срезов от каждого животного и включить не менее трех животных для каждого конкретного экспериментального условия. Создайте проекции максимальной интенсивности из групп по три последовательных среза, чтобы получить пять проекций, каждая из которых представляет 1 micron глубины.

Количественный анализ проводили с помощью Image J, как описано для RG Cs, с использованием модифицированной области интереса (ROI) для определения количества синапсов, сформировавшихся в отсутствие астроцитов. Иммунохимический анализ был выполнен на диссоциированных rgc, культивируемых в базовой ростовой среде, с использованием антител к bassoon (показан красным) и homer (показан зеленым), что соответствует ожидаемому результату. Наблюдается очень мало точек синаптической колокализации. Для определения влияния молекул, секретируемых астроцитами, на количество синапсов, сформированных in vitro, диссоциированные RG Cs обрабатывали кондиционированной средой мышиных астроцитов каждые три дня в течение 12 дней, после чего проводили окрашивание.

В этом нейроне было отчетливо видно множество синапсов, но вскоре soon показан красным цветом. Homer показан зеленым цветом; диссоциированные RDC, трансфицированные цитоплазматическим Lee с экспрессией TD tomato, обрабатывали только базальной ростовой средой. Синапсы не наблюдаются.

TD томаты видны синим цветом, а синапсы — красным. Сигнал от постсинаптического маркера homer, показанного зеленым цветом, выражен очень слабо. При длительном воздействии на те же клетки кондиционированной среды астроцитов крысы наблюдается большое количество синапсов.

Здесь TD tomato окрашен в синий цвет, синапсин — в красный, а homer — в зеленый. Показана очищенная ганглиозная клетка сетчатки (RGC), обработанная кондиционированной средой астроцитов и окрашенная на пресинаптические маркеры (красный цвет) и постсинаптические маркеры homer (зеленый цвет); пороговые маски, созданные с помощью Puncta analyzer, соответствуют двум имеющимся каналам. После выявления точек колокализации Puncta analyzer выводит графическое представление этих точек.

Программа puncta analyzer предоставляет числовой результат, указывающий количество дискретных пунктат, выявленных в обоих каналах, а также в точках колокализации. Данные, полученные в результате анализа этого нейрона, иллюстрируют способность секретируемых астроцитами молекул стимулировать формирование синапсов; здесь это представлено в виде анализа синапсов, в котором количественно определялась колокализация пре- и постсинаптического иммуногистохимического окрашивания для демонстрации потенцирования индуцированного астроцитами синаптогенеза при гиперэкспрессии нейронального рецептора к важному секретируемому астроцитами синаптогенному веществу тромбоспондину. На данном рисунке показано среднее количество синапсов на нейрон при длительном воздействии базовой ростовой среды, gm или кондиционированной среды астроцитов.

A-C-M-A-C-M более сильно стимулирует образование синапсов в ганглионарных клетках сетчатки, сверхэкспрессирующих тромбоспондиновый рецептор, по сравнению с клетками, сверхэкспрессирующими пустой вектор. Для количественного определения плотности синапсов в верхнем холмике мозга мыши пре- и постсинаптические отделы были раздельно помечены с помощью специфических иммуногистохимических маркеров. Как показано здесь, наблюдалось увеличение количества синапсов с седьмого постнатального дня до P 14.

Здесь показано увеличение количества синапсов в верхнем This illustrates the increase in synapse number in the superior ulus в этот период развития. После освоения данный протокол может быть выполнен примерно за два дня для диссоциированных нейронных культур и примерно за пять дней для срезов мозга, полученных от животного согласно этой процедуре. Для подтверждения того, что изменения количества синапсов отражают изменения как функциональных синапсов, так и ультраструктурно нормальных синапсов, используются другие методы, такие как электрофизиология и электронная микроскопия соответственно.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как применять иммуногистохимический метод к вашему экспериментальному препарату для количественного определения количества синапсов. В данном протоколе подробно описано, как использовать антитела, специфичные к определенным компартментам, для селективного мечения пре- и постсинаптических структур. В данном контексте мы определяем синапсы как точки колокализации сигналов, полученных от каждого из этих маркеров.