Количественная Синапсы: Иммуноцитохимическая основе Пробирной количественно Synapse Количество

Одной из наиболее важных целей нейробиологии является понимание молекулярных сигналов, которые управляют ранними стадиями формирования синапсов. Таким образом, стало необходимым разработать объективные подходы для количественной оценки изменений в синаптических связях. Для количественного определения количества синапсов в различных экспериментальных препаратах культивируемые нейроны или препараты тканей мозга на криосечении окрашивают селективными пре- и постсинаптическими маркерами для обозначения точек синаптического контакта между нейронами.

Затем клетки или ткань визуализируются на флуоресцентном микроскопе, и для каждого из каналов требуется восемь битных изображений, соответствующих двум иммуногистохимическим маркерам. Изображения анализируются с помощью изображения J 1.29 с помощью анализатора точек зрения. Чтобы определить степень колокализации между пре- и пост-синаптическими маркерами, точки колокализации могут быть использованы для определения количества синапсов, присутствующих в препарате.

Основное преимущество описанного здесь метода по сравнению с существующими методами, такими как электронная микроскопия, заключается в том, что анализ синапсов позволяет проводить анализ с гораздо большей пропускной способностью и количественную оценку числа синапсов. Основные последствия этого метода распространяются на диагностику и терапию клинических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, эпилепсия или аутизм, в которых аномалии и синаптические связи были вовлечены в качестве основы для основной патологии. Этот метод может быть использован для определения форм вмешательства, которые могут уменьшить или улучшить недостатки, которые мы наблюдаем в способности пораженных нейронов формировать синапсы друг с другом.

Хотя этот метод полезен для изучения развития мозга, он также может быть применен к другим модельным организмам или системам органов, в которых вас интересует изучение или количественная оценка количества межклеточных контактов, для которых у вас есть возможность выборочно пометить каждую противоположную сторону каждого контактного участка. Получение культур нейронов путем гальванизации ганглиозных клеток сетчатки крысы, выделенных из сетчатки крысы, собранных у P от пяти до семи животных, на стеклянных покровных листах, покрытых поли-делицином. В 24-луночном планшете клеткам позволяют расти при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти дней до трансфекции.

После трансфекции инкубируйте клетки в течение дополнительных семи-восьми дней, чтобы дать возможность развиться синапсам, когда пластинчатые клетки достаточно созреют. Выньте питательную среду из лунок и добавьте 500 микролитров предварительно подогретого, 4%-ного параформальдегида в каждую лунку, зафиксированную в течение семи минут. При комнатной температуре после фиксации трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером.

Важно следить за тем, чтобы клетки никогда не пересыхали в лунках. После того, как буфер удален из скважины, он должен быть немедленно заменен следующим буфером. Приготовьте блокирующий буфер, содержащий 50% обычной козьей сыворотки и 0,2% Тритона X 100.

После удаления PBS из каждой лунки хорошо добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку и заблокируйте на 30 минут. При комнатной температуре снимите блокирующий буфер и промойте три раза. С помощью PBS приготовьте первичное разведение антител в 90%-ном буфере антител, 10%-ном растворе NGS, содержащем пару пре- и постсинаптических антител по выбору.

Здесь кролик антис синапсин, пресинаптический маркер и мышиный анти гомер. В качестве постсинаптического маркера используется центрифуга, первичный разведение антител в течение пяти минут на максимальной скорости в настольной центрифуге для удаления любого осажденного антитела, после чего в каждую из них добавляется по 200 микролитров раствора первичного антитела. Хорошо поместите тарелку во увлажненную емкость, чтобы предотвратить высыхание первичного раствора.

Инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия после инкубации с первичными антителами. Промойте каждую лунку три раза. Вместе с PBS добавьте 200 микролитров соответствующих вторичных антител, разведенных один к 1000 в буфере для антител, содержащем 10% приготовленного NGS.

Как и раньше, поместите чашку во увлажненную камеру и выдерживайте в течение двух часов при комнатной температуре в темноте после инкубации с вторичными препаратами. Промойте каждую лунку три-четыре раза PBS. Поместите каплю монтажного материала векторного экрана с разрешением DPI на предметное стекло.

Затем переверните покровное стекло с элементами на каплю для крепления. Наконец, нанесите прозрачный лак для ногтей по краям покровного стекла. Будьте осторожны, чтобы не подтолкнуть или не сдвинуть защитные стекла во время нанесения.

Поскольку это позволит делить клетки, дайте предметным стеклам высохнуть не менее 30 минут в сухом темном месте. Здесь визуализация выполняется с помощью флуоресцентного микроскопа zes axio, оснащенного соответствующими наборами фильтров и объективом для погружения в масло с 63-кратным увеличением. Поместите предметное стекло с нетрансфицированными клетками на предметный столик микроскопа.

Используя набор фильтров DPI для визуализации ядра клеток, выберите клетки, которые находятся на расстоянии не менее двух диаметров от своих ближайших соседей. Использование DPI на этом этапе поможет избежать предвзятости и обеспечит случайность выбора клеток. Для каждой выбранной ячейки получите восьмибитные изображения с использованием соответствующих наборов фильтров, в данном случае GFP и Texas Red.

Наложенное псевдоцветное изображение должно показывать пре- и постсинаптические маркеры красным и зеленым цветом соответственно. Затем поместите предметное стекло с трансфицированными клетками на предметный столик микроскопа. Здесь клетки были трансфицированы с помощью вектора экспрессии томатов TD.

Используйте этот маркер для выделения ячеек, как и раньше. Для каждой выбранной ячейки получите восемь изображений ямок, используя соответствующие наборы фильтров, в данном случае GFP, Texas Red и Sci пять. Наложенное псевдоцветное изображение должно иметь постсинаптические маркеры красного, зеленого и синего цветов.

В данном случае программа анализатора пункции используется для количественной оценки колокализованной синаптической пунктуры. Плагин анализатора Puncta был написан Барри Уолком и доступен по запросу в образе J 1.26. Откройте одно из собранных изображений.

Используйте инструмент кругового выделения для выбора области примерно на один диаметр ячейки радиально вокруг интересующего СОР. Выбрав интересующую область, перейдите в меню плагинов и в появившемся окне параметров анализа выберите «Анализатор проколов». Первый вычитает фон и устанавливает файл результатов.

Нажмите OK. Затем определите местоположение, в котором будут сохранены результаты. Эти результаты можно экспортировать в Excel для дальнейшего анализа в появившемся окне.

Затем убедитесь, что выбран радиус катящегося шара 50, и снимите галочку с опции белого фона. Эта модификация не является обязательной, но часто предпочитается пользователями приложения. Для удобства визуализации нажмите кнопку «ОК».

Новое окно появится рядом с маской, соответствующей изображению красного канала. Регулируйте порог до тех пор, пока красная маска не будет соответствовать как можно лучше с как можно большим количеством незаметных отдельных проколов. Не добавляя слишком много шума, нажмите «Готово».

Установите минимальный размер знаков препинату равным четырем пикселям. Больше ничего не изменяйте. Нажмите OK.

Повторите предыдущий шаг, на этот раз для зеленого канала. Повторив это с зеленым каналом, плагин обеспечит количественную оценку, соответствующую пунктам в каждом канале отдельно, и локализованную точку между двумя каналами. Показанный здесь анализ синапсов может быть применен к криогенным срезам головного мозга и к любой другой ткани нервной системы, такой как спинной мозг или сетчатка.

При условии наличия подходящей пре- и постсинаптической маркерной пары. Начните с забора мозговой ткани у мыши, которая была усыплена путем обескровливания и обильного приема PBS. Поместите весь мозг в 4%-ный паральдегид в PBS при температуре четыре градуса Цельсия на ночь следующего дня.

Трижды промойте мозг с помощью PBS. Крио защищает мозг, помещая в него 30% сахарозы. В PBS.

Первоначально ткань будет плавать при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока ткань не опустится на дно. На этом этапе криозащита завершена. Далее в соотношении два к одному раствора 20% сахарозы к ОКТ и ПБС встроить мозгин в нужную ориентацию для разрезания.

Например, сагиттальный или корональный. Далее положите плоскую металлическую поверхность поверх ведра с сухим льдом. Поместите на него встроенный мозг, чтобы он застыл после замораживания, перенесите мозг в пакет для заморозки и поместите его при температуре минус 80 градусов Цельсия на срок до года перед разделением.

С помощью криостата ткань разрезается на срезы размером от 12 до 16 микрон и устанавливается на предметные стекла. Далее высушите горки, поместив их в духовку при температуре 37 градусов Цельсия. Затем трижды промойте их PBS, чтобы удалить остатки ОКТ.

Парафиновая ручка используется для создания гидрофобного барьера вокруг предметного стекла, а к предметному стеклу добавляется блокирующий буфер, предотвращающий стекание с предметного стекла парафиновой границей. Поместите предметные стекла в 20% обычную козью сыворотку в PBS на один час при комнатной температуре, чтобы заблокировать следующее место. Срезы в первичных антителах разводят в PBS с 0,3% тритона и 10% нормальной козьей сыворотки.

Здесь для обозначения глутаматергических, постсинаптических компартментов используется rabbit anti, а для обозначения глутаматергических пресинаптических окончаний используется rabbit anti v glu two. Поместите предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия и инкубируйте в течение 36–60 часов после инкубации. Смойте первичное антитело, погрузив предметные стекла три раза в PBS на 15 минут каждое.

После этого шага обязательно защитите горки от прямого света. Применяйте вторичные антитела, разведенные от одного до 200 в PBS с 0,3% тритона и 10% обычной козьей сыворотки. Здесь козел анти морская свинка.

Alexa 4, 8, 8 и козий антикролик. Используются Alexa 5, 9, 4. Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре в темноте.

Промойте слайды, погрузив их четыре раза в PBS на 15 минут каждый для крепления. Добавьте небольшие капли крепежного носителя векторного щита с помощью накладки и накройте слайды покровными накладками. Нанесите лак для ногтей, чтобы предотвратить движения покровных стекол.

Визуализацию среза ткани следует проводить с помощью конфокального микроскопа с соответствующими лазерами с использованием объектива с 63-кратным масляным погружением для каждого изображения среза, серийных оптических срезов с интервалом 0,33 мкм на общую глубину пять мкм, всего 15 оптических срезов. По крайней мере, три среза каждого животного должны быть изображены и по крайней мере три животных из данного экспериментального условия. Сгенерируйте проекции максимальной интенсивности из групп из трех последовательных секций, получив пять проекций, представляющих глубину в один микрон каждая.

Они количественно оцениваются с помощью изображения J, как описано для RG Cs с модифицированным ROI для определения количества синапсов, образующихся в отсутствие астроцитов. Иммунохимический анализ проводили на диссоциированных rgc, обработанных базальными питательными средами, с использованием антител против фагота, показанных красным цветом, и антител Гомера, показанных зеленым, как и ожидалось. Для определения влияния секретируемых астроцитами молекул на количество синапсов, образованных in vitro, диссоциированных RG Cs обрабатывали кондиционированными средами астроцитов мышей каждые три дня в общей сложности в течение 12 дней после окрашивания.

В этом нейроне были заметны многочисленные синапсы, но вскоре он был показан красным цветом. Гомер показан в зеленом цвете диссоциированных RDC, трансфицированных цитоплазматическим экспрессией TD томата Lee, которые лечили только базальным ростом. Средние синапсы не видны.

Помидор TD виден синим цветом, а синапс внутри — красным. Очень мало сигнала видно для постсинаптического маркера Гомера, показанного зеленым цветом. Когда одни и те же клетки хронически обрабатываются средой, кондиционированной астроцитами крысы, видны многие синапсы.

TD помидор здесь синий, синапсин — красный, а гомер — зеленый. Показано, что очищенный РГК был обработан кондиционированной средой астроцитов и окрашен для пресинапса в красный цвет, а постсинаптические маркеры зеленого Гомера, пороговые маски, сгенерированные с помощью анализатора пункций, соответствуют двум присутствующим каналам. После выявления точек колокализации анализатор Puncta выдает графическое представление этих точек.

Числовой вывод выводится с помощью анализатора точек, который указывает количество дискретных точек, идентифицированных в обоих каналах и для точек колокализации. Данные, полученные в результате анализа этого нейрона, иллюстрируют способность секретируемых астроцитами молекул способствовать образованию синапсов, показанную здесь в виде анализа синапсов, в котором была количественно определена колокализация пре- и постсинаптического иммуногистохимического мечения, чтобы продемонстрировать потенцирование образования синапсов, индуцированного астроцитами, путем сверхэкспрессии нейронального рецептора важной синап-генной молекулы астроцитов тромбо-спона. На этом рисунке показано среднее количество синапсов на нейрон, хронически обработанных базальными питательными средами, gm или астроцитарными кондиционированными средами.

A-C-M-A-C-M сильнее способствует образованию синапсов в ганглиозных клетках сетчатки по сравнению с клетками, экспрессирующими пустой вектор. Для количественной оценки синаптической плотности в верхних колликулусах мышей пре- и постсинаптические компартменты были отдельно помечены с использованием компартмент-специфичных иммуногистохимических маркеров. Как показано на рисунке, наблюдалось увеличение числа синапсов с 7-го дня после рождения до 14-го дня.

Это иллюстрирует увеличение числа синапсов в верхнем улусе в течение этого временного окна развития. После освоения этот протокол может быть завершен примерно за два дня для культур диссоциированных нейронов и примерно через пять дней для участков мозга после забора у животного после этой процедуры. Другие методы, такие как электрофизиология и электронная микроскопия, используются для проверки того, что изменения в количестве синапсов отражают изменения как в функциональных синапсах, так и в ультраструктурно нормальных синапсах соответственно.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как применять иммуногистохимию к вашему экспериментальному препарату для количественного определения числа синапсов. В этом протоколе подробно описано, как использовать антитела, специфичные для компартментов, для селективной маркировки пре- и пост-синаптических компартментов. В этом контексте мы определяем синапсы как точки колокализации между сигналами, полученными от каждого из этих маркеров.