96 Ну планшет метода, основанного на формировании мониторинга и тестирования Противогрибковые Восприимчивость Candida Albicans Биопленки

Общая цель этой процедуры заключается в формировании биопленок Candida albicans и изучении их чувствительности к противогрибковым препаратам. Это достигается путем предварительного формирования этих грибковых биопленок на лунках 96. Ну, микротитровальные планшеты, затем противогрибковые препараты добавляются к предварительно сформированным биопленкам и инкубируются в течение 24-48 часов после инкубации.

Холеметрический метод, который измеряет метаболическую активность клеток внутри биопленок, используется для измерения активности этих противогрибковых препаратов с целью установления минимальной ингибирующей концентрации противогрибковых препаратов по отношению к биопленкам. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые демонстрируют способность формировать биопленки и тестировать чувствительность к противогрибковым препаратам с помощью простого и удобного метода на основе 96-луночного микротитра в сочетании с показаниями цветовой метрики. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост, относительно недорог, обладает высокой воспроизводимостью и позволяет формировать несколько эквивалентных биопленок.

Кроме того, он совместим с технологией 96-луночной платформы, обычно доступной в большинстве исследовательских и клинических лабораторий. Применение этой техники распространяется и на терапию псовых. Так как очень часто эти инфекции связаны с образованием биопленки.

Используя надлежащие методы микробиологической обработки, извлеките петлю, полную клеток, из свежей субкультуры альбиканов на медной пластине SAU и инокулируйте в колбу Эрленмейера объемом 125 миллилитров, содержащую 25 миллилитров дрожжевого бульона пепан-декстрозы, поместите культуру в орбитальный шейкер с температурой 180 RRP M и 30 градусами Цельсия и инкубируйте в течение ночи после ночной инкубации. Разлейте дрожжевые культуры в конические пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при 3000 RBM в течение пяти-10 минут. Отбросьте надосадочный вихрь.

Гранулы энергично десегрегируют клетки. Затем добавьте стерильный PBS для промывки перед тем, как снова центрифугировать культуры. Повторите этот этап промывки еще раз, чем снова согните ячейки.

Примерно в 20 миллилитрах RPMI 1640, среда буферизуется до pH 7,0. Используя раствор 165 миллимолярных швабр и предварительно подогретый до 37 градусов Цельсия из этой суспензии, готовят разведение один к 100 с помощью стандартного гемоцитометра и светлопольного микроскопа. Посчитайте клетки.

Затем приготовьте окончательную суспензию клеток в соотношении 10 из шести на миллилитр в теплой буферной среде RPMI 1640. С помощью многоканальной пипетки по 100 мкл суспензии морского альбикана в выбранные лунки стерильной 96-луночной микротитровой пластины с плоским дном. Скважины в столбце 12 оставьте пустыми, так как они будут служить в качестве отрицательного контроля.

Накрыв и запечатав планшет параформом, инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, чтобы дать возможность сформироваться биопленкам. После инкубации осторожно аспирируйте и выбросьте среду из каждой лунки. Следя за тем, чтобы не нарушить биопленки, образовавшиеся на дне.

Промыть по 200 микролитров PBS в каждую лунку и слить, тщательно перевернув и промокнув тарелку на стопке бумажных полотенец. Повторите этот шаг стирки три раза. На этом этапе биопленки обнаруживаются на глаз и могут быть визуализированы с помощью инвертированного микроскопа с помощью СЭМ.

Мы можем оценить, что биопленки состоят из переплетенной смеси нитей и дрожжевых клеток. После того, как образование биопленки было проверено, можно приступать к тестированию противогрибковых агентов с использованием буферизованных рабочих растворов высокой концентрации для подготовки среды RPMI 1640 противогрибковых агентов, подлежащих испытанию. Типичные высокие концентрации составляют 1024 микрограмма на миллилитр для флуконазола и 16 микрограммов на миллилитр для амфотерицина B и CASPO fungi beri.

Далее добавьте 200 микролитров противогрибковых растворов в лунки в первой колонке и 100 микролитров буферизованного RPMI 1640. От средних до лунок в столбцах со второй по 11. Проведите серию серийных двойных разведений путем переноса 100 микролитров противогрибковых растворов высокой концентрации из лунок первой колонны в лунки второй колонны.

После осторожного пипетирования вверх и вниз перемешать пипетку 100 мкл из лунок колонки два в лунки столбца три и так далее до столбца 10. Не добавляйте в колонку 11 какой-либо противогрибковый раствор, так как он послужит положительным контролем и выбросьте последние 100 микролитров из колонки 10 лунок. Все скважины, кроме указанных в колонке 12.

Теперь должен иметь итоговый объем 100 микролитров. Накройте пластину, запечатайте ее отдушкой и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24-48 часов, чтобы противогрибковые препараты подействовали после инкубации. И после трехкратной промывки пластины в PBS, как описано ранее, добавьте 100 микролитров раствора медиона XTT на лунку во все лунки, включая отрицательные контрольные лунки.

В колонке 12. Накройте тарелку, оберните ее алюминиевой фольгой, чтобы защитить от света, и выдержите при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Чтобы обеспечить развитие цвета после инкубации, разверните пластину.

Первоначально прозрачный раствор XTT станет оранжевым после обработки метаболически активными клетками. Перенесите 80 микролитров цветной надосадочной жидкости в свежую микротитровальную пластину с плоским дном. Используйте считыватель пластин с колометрическим микротитрованием, установленный на длине волны 490 нанометров, для считывания показаний, как показано здесь В отсутствие противогрибковых препаратов колорометрические показания не обрабатывались.

Биопленки заявителя SEA в разных рядах равноценны. Чтобы оценить действие исследуемых в первую очередь противогрибковых соединений, вычтите среднее фоновое значение, полученное из отрицательных контрольных лунок в столбце 12, из всех остальных значений. Затем рассчитайте процент торможения с помощью положительного контроля в строке 11.

В качестве максимальных значений противогрибковые концентрации, при которых обнаруживается снижение колориметрических показателей на 50% или 80%, известны как минимальные ингибирующие концентрации Сесила. Эти значения обычно используются в качестве эталонной меры эффективности соединения. Используя этот простой высокопроизводительный метод, грибковые биопленки могут быть сформированы in vitro в течение 24 часов, а выбранные соединения могут быть проверены на противогрибковую активность после их первоначального развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области медицинской микологии к изучению образования биопленки и изучению активности противогрибковых агентов. Опять же, клетки в биопленках.