Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

Электрофизиология обычно используется для изучения активности рекомбинантных потенциал-зависимых ионных каналов в культивируемых эмбриональных клетках почек человека. Успешная запись требует, чтобы клетки экспрессировали каналы на достаточном уровне клеточной мембраны для обнаружения и чтобы клетки были покрыты с достаточно низкой плотностью для выделения отдельных клеток. Проведение клеточных записей часто затруднено длительными инкубационными периодами при температуре 28 градусов Цельсия, необходимыми для такой экспрессии, где обычно происходит потеря клеточной адгезии и стабильности мембраны.

В данной работе демонстрируется оптимизированный метод культивирования и трансфекции клеток, который позволяет обойти эти проблемы. Клетки трансфицируют при умеренной плавности, а затем инкубируют при температуре 28 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет достигнута адекватная экспрессия ионных каналов. Затем трансфицированные клетки наносят на стеклянные покровные стекла с низкой плотностью и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение нескольких часов, чтобы обеспечить прикрепление клеток и стабилизацию мембраны.

После того, как клетки были надлежащим образом покрыты, их идентифицируют с помощью коэкспрессируемого EGFP и целого клеточного патч-зажима. Может быть выполнена запись или еще раз инкубированы клетки при температуре 28 градусов Цельсия. Для дальнейшего увеличения экспрессии поверхности каналов результаты экспериментов по регистрации на клетках, трансфицированных потенциал-зависимыми кальциевыми каналами, такими как L CAV один, L CAV два или L cav три, указывают на то, что каналы были успешно трансфицированы и экспрессированы клетками.

Несмотря на то, что в нашей лаборатории представлены только репрезентативные результаты для L CAV 3, мы разработали метод повышения экспрессии плохо экспрессирующих генов ионных каналов для записи патч-клэмпов в клеточных линиях человека. В настоящее время традиционный подход заключается в том, чтобы сначала разделить клетки на покровных листках и трансфектировать плазменными CDNA, содержащими гены ионных каналов, а затем инкубировать в течение многих дней при температуре 28 градусов Цельсия для достижения высокоэффективной экспрессии ионных каналов перед электрофизиологической регистрацией. Наш новый подход значительно сокращает необходимое время инкубации при 28 градусах Цельсия перед регистрацией.

Теперь, уменьшив время инкубации на 28 градусов, мы обнаружили, что клеточные мембраны стали гораздо более стабильными, а трансфицированные клетки гораздо лучше прилипают к покровным стеклам. Это увеличивает количество регистрируемых ячеек и значительно повышает эффективность экспериментов. Перед трансфекцией полностью сливающуюся колбу с 2 9 3 Т-клетками HEK, от одного до четырех в новую 25-сантиметровую квадратную колбу и поместите клетки в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Дайте элементам прикрепиться в течение трех-четырех часов через четыре часа, осмотрите элементы с помощью дифференциального интерференционного контраста, чтобы убедиться в прикреплении. Обратите внимание, что ячейки больше не выглядят круглыми и сплющиваются. Видны отростки или псевдоподии.

Ячейки с меньшим количеством слияний выглядели бы так же, но были бы расположены дальше друг от друга. После того, как клетки прилипли, объедините необходимые реагенты для выполнения стандартной трансфекции фосфата кальция. Приготовьте в общей сложности 12 микрограммов ДНК в 600 микролитрах раствора для трансфекции на одну колбу.

Здесь КДНК из различных ионных каналов клонируются в P-I-R-E-S две EGFP плазмидные трансфекции этого экспрессионного вектора в клеточную линию млекопитающих. Приводит к получению усиленного зеленого флуоресцентного белка из той же мРНК, что и клонированная вставка, путем трансляции, инициированной во внутреннем сайте входа рибосомы, расположенном непосредственно после последовательности покрытия ионного канала и перед последовательностью покрытия EGFP. Это позволяет идентифицировать положительно трансфицированные клетки без возможного вмешательства в функцию белка, которое может быть вызвано слиянием белка EGFP непосредственно с интересующим белком.

Нанесите раствор для трансфекции на клетки по каплям, затем осторожно взболтайте колбу и поместите ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь на следующий день. Проверьте эффективность трансфекции, рассматривая клетки под флуоресцентным микроскопом. Положительно трансфицированные клетки должны выглядеть зелеными по всей длине клетки.

После того, как трансфекция будет проверена, осторожно нанесите четыре-пять миллилитров теплой среды в перевернутую колбу. Промойте ячейки, медленно переворачивая колбу так, чтобы поверхность ячейки была опущена, и покачивая колбу так, чтобы раствор для промывки мягко двигался по ним. Удалите среду и повторите эту стирку.

Сделайте еще два шага. Затем добавьте в колбу шесть миллилитров среды и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Экспрессия ионных каналов беспозвоночных сопряжена с некоторыми проблемами.

Во-первых, они часто имеют большой размер и поэтому могут занять много времени для переноса в эндоплазматический ретикулум. Кроме того, они могут быть неэффективно нацелены на клеточную мембрану в клеточной линии млекопитающих. Наконец, поскольку разные виды демонстрируют разную частоту использования кодонов, гетерологичные КДНК могут содержать высокие частоты кодонов, которые редко встречаются в клетках млекопитающих, такие как HEK 2 9 3 T, чтобы преодолеть некоторые из этих трудностей.

После двухчасовой инкубации при 37 градусах Цельсия после промывки трансфекта перенесите колбы в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия на два-шесть дней, чтобы продлить период сцеживания. Время инкубации должно быть определено опытным путем для каждого типа экспрессируемого ионного канала. Так как инкубация при температуре 28 градусов Цельсия в течение длительных периодов времени приводит к отслоению клеток и плохой стабильности мембраны.

Перед проведением электрофизиологических исследований необходима дальнейшая подготовка клеток. Сначала удалите среды из трансфицированных клеток с помощью аспирационной пипетки: один миллилитр раствора трипсина 37 градусов Цельсия в перевернутую колбу. Затем осторожно верните колбу на поверхность клетки в нижнее положение, чтобы трипсин мягко протекал по клеткам.

Переверните колбу обратно и удалите трипсин. Затем добавьте 250 микролитров теплого трипсина непосредственно на клетки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут, пока клетки не отделятся. Тем временем поместите от трех до восьми покрытых поли L лизином крышек в 60-миллиметровую чашку для культур и добавьте пять миллилитров теплой питательной среды.

После того, как клетки отсоединились, суспензируйте их в четырех миллилитрах теплой среды, пипетируя вверх и вниз около шести раз, затем с помощью кончика микропипетки надавите на крышки, чтобы убедиться, что они находятся на дне чашки. Затем добавьте от 250 до 500 микролитров ресуспендированных клеток. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов, чтобы они могли прилипнуть к покровным стеклам.

Слишком долгое пребывание в клетках при температуре 37 градусов приведет к делению клеток и разведению трансфицированных плазмид. Трансфицированные клетки должны быть покрыты с достаточно низкой плотностью, чтобы они были изолированы друг от друга, как показано здесь. Это облегчит электрофизиологическую запись.

Для клеток, которым требуются вспомогательные субъединицы, часто необходимо перенести клетки при температуре 28 градусов Цельсия и инкубировать их еще три-четыре дня до электрофизиологической. Запись осуществляется для ячеек, не требующих вспомогательных субъединиц. Запись может быть выполнена сразу после инкубации.

Используемый здесь электрофизиологический стенд включает в себя усилитель, моторизованный, манипуляторы с двумя пипетками, эпифлуоресцентный микроскоп и перфузионные системы. Оборудование было смонтировано на виброизоляционном столе и приблуждающемся. Электрический шум ограничен 40-дюймовым типом с двумя клетками для хорьков Электронные системы управления, включающие ПК, оснащенный цифровыми данными 1440, интерфейс аналого-цифрового преобразователя в сочетании с программным обеспечением P clamp 10.1.

Усилитель компьютерного монитора, моторизованный манипулятор и система контроля мощности клапанного звена установлены снаружи клетки Фарадея. На отдельно стоящей 19-дюймовой металлической электрической стойке все электрооборудование заземлено к медному распределителю и подключено к изолирующему трансформатору медицинского класса, который обеспечивает изоляцию линии, постоянное заземление и подавление перенапряжений. Подготовьтесь к экспериментам, установив отполированные огнем микропипетки с сопротивлением от двух до пяти мегаом на держателе микропипеток на головном столике.

Патч-пипетки заполняются внутренним раствором для удаления пузырьков воздуха и, наконец, устанавливаются на головной стол. Далее с помощью щипцов переносят один покровный листок с металлизированными ячейками в 35-миллиметровую пластиковую чашку Петри, содержащую три миллилитра раствора для наружной записи при комнатной температуре. Объем регистрируемого раствора необходимо точно измерить при проведении экспериментов с лекарственными препаратами, в ходе которых известные количества лекарственного средства добавляют в чашку с помощью микропипетки, помещают чашку на предметный столик микроскопа.

Затем заполните полуячейку микроэлектрододержателя тремя молярами хлорида цезия. Затем вставьте электрод сравнения в полуячейку и поместите заземляющий электрод в ванну с помощью манипулятора микрома, опустите патч-пипетку в раствор ванны. Визуализируйте клетки в флуоресцентном режиме и центрируйте изолированную положительно трансфицированную адгезивную зеленую клетку в центре поля зрения.

Находясь в режиме ванны, поднесите патч-пипетку в непосредственной близости от ячейки. Обнулите квадратную кривую волны, наблюдаемую на экране компьютера. Отрегулируйте положение патч-пипетки так, чтобы она просто касалась ячейки, а квадратная кривая тока на экране начала колебаться.

Применяйте мягкое отсасывание с помощью прилагаемого шприца до образования гигаомного уплотнения. Как только будет достигнуто уплотнение в гигаом, переключите программу в режим патча. Надавите на шприц быстрым импульсом всасывания для того, чтобы прорвать клеточную мембрану.

Затем переключитесь в режим ячейки и используйте параметры всей ячейки на усилителе. Чтобы компенсировать емкостный переходный процесс, необходимо уравновесить пластырь таким образом, чтобы раствор внутриклеточной записи диализировался в запатченную клетку. Введите протоколы клещей напряжения, записанные для этого эксперимента, здесь.

Экспериментатор разработал протокол для измерения ионных токов через напряженные ионные каналы, которые образуются при модуляции напряжения на клеточной мембране. В данном случае мы рассматриваем протокол внутривенного введения, который указывает, что программное обеспечение удерживает ячейку при напряжении минус 110 милливольт, а затем SEP до минус 70 милливольт в течение 250 миллисекунд. Затем вернитесь к минус 110 милливольтам, удерживая потенциал каждый раз, когда шаг увеличивается на 10 милливольт, так что шаги равны минус 70 милливольт, минус 60 милливольт и так далее, пока последний шаг не будет плюс 20 милливольт.

Фильтруйте записанные токи с частотой 10 килогерц с помощью фильтра Бесселя нижних частот на усилителе и оцифруйте с частотой дискретизации два килогерца с помощью программного обеспечения Clamp X 10.1 используйте только записи с минимальной утечкой менее 10%Для анализа HEK 2 93 Т-клетки культивировали и трансфицировали L-кав. Три кальциевых канала, как показано здесь. Об успешной трансфекции гетерологичных ионных каналов CDNA свидетельствовала флуоресценция, полученная из вектора P-I-R-E-S двух ЭЭГ ФП.

Здесь мы показываем успешную экспрессию трехвольтного кальциевого канала у беспозвоночных. Когда клетки не трансфицированы, никакие токи кальция не могут быть вызваны. В то время как трансфицированные элементы генерируют большие токи, когда к клеткам применяются протоколы клеммеров напряжения всей ячейки.

Экспериментаторы могут использовать различные электрофизиологические условия и схемы анализа данных в зависимости от своих потребностей. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно использовать собственное суждение о сроках проведения экспериментов. Поскольку различные каналы экспрессируются с разной эффективностью на клеточной мембране, вы должны определить оптимальную стратегию, которую следует использовать для повышения жизнеспособности клеток, а также для максимизации поверхностной экспрессии интересующих вас каналов.

Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы хорошо поняли, как культивировать и поддерживать клеточную линию человека, а также как трансфицировать гетерологичные ионные каналы CDNA и субъединицы CDNA в эти клетки. Для электрофизиологической регистрации.