В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B ₄ Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin

Эта статья описывает методологию для определения хемотаксиса лейкоцитов ответ на специфических лигандов и определить взаимодействие между рецепторами клеточной поверхности и цитозольного белков с использованием живых методов визуализации клеток.

Лейкотриен B 4 представляет собой провоспалительную молекулу, которая опосредует его действие через рецепторы, сопряженные с G-белком, BT 1 и BT 2 на различных воспалительных клетках. Было показано, что путь LTB четыре B LT one имеет решающее значение при нескольких воспалительных заболеваниях, включая астму, артрит и атеросклероз. Рецепторы, сопряженные с G-белком, или gPCR, опосредуют трансдукцию внеклеточных сигналов, которые вызывают внутриклеточные реакции, такие как хемотаксис, внутриклеточное высвобождение кальция и регуляция генов.

Связывание внеклеточных лигандов вызывает ряд подтверждающих изменений, которые приводят к активации гетеротримерных G-белков. Затем G-белок модулирует уровни второго посредника, такого как циклический аденозинмонофосфат, ацетолтрифосфат и дилглицерин для мониторинга миграции лейкотриен-4 опосредованных клеток в реальном времени дендритных клеток, полученных из костного мозга, или B-MDC, визуализируются, в то время как сравниваемые доставляются с помощью контролируемого потока из микропипетки. Для оценки миграции выполняется покадровая съемка.

Используя эти методы визуализации живых клеток в режиме реального времени, наша лаборатория обнаружила, что рецептор BT one лейко тренда B 4 функционально экспрессируется на дендритных клетках. Мы также выявили фосфорилирование и бета-арест и зависимые механизмы интернализации BT one. Д-р Джла и доцент нашей лаборатории, разработавшие многие из этих методов, продемонстрируют как миграцию живых клеток, так и интернализацию рецепторов: Чтобы получить дендритные клетки, полученные из костного мозга, или B-MDC для анализа миграции клеток, наносите 0,5 миллиона клеток в культуральную среду RPMI 1640, содержащую рекомбинантный FPS G-M-C-S-F и рекомбинантный FLT, три на 35-миллиметровом стеклянном дне.

После нанесения на поверхность инкубируйте клетки в течение 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа через 16 часов. Добавьте три миллилитра PBS и аспирируйте. Повторите эту полоску еще не менее двух раз после последней аспирации, добавьте в тарелку два миллилитра PBS.

Теперь клетки готовы к эксперименту и должны поддерживаться при температуре 37 градусов по Цельсию. До тех пор система визуализации, используемая для экспериментов в этом видео, состоит из эпифлуоресцентной системы A-T-E-F-M, прикрепленной к инвертированному микроскопу Nikon Eclipse TE 300, оснащенной нагревательным столиком и холодным HQ SNAP. Цифровая черно-белая ПЗС-камера.

Волны возбуждения и излучения управляются с помощью фильтровальных колес и контроллера Lambda 10 с двумя фильтрами. Аппаратное управление и получение изображений управляются программным обеспечением metamorph. К столику микроскопа прикреплены два микроманипулятора для удержания пипеток, которые могут быть изготовлены в соответствии с инструкциями в сопроводительном тексте или приобретены.

Перенесите 1,5 миллилитра из 100 наномолярного запаса провоспалительного лиганда лейкотриена В четыре или LTB 4 в 1,5 миллилитровую фуге-пробирку. Заполните микропипетку, поместив наконечник микропипетки в раствор, и позвольте раствору войти в этот способ загрузки, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха на конце микропипетки. Затем загрузите туберкулиновый шприц объемом в один кубический сантиметр, прикрепленный к игле микронаполнителя, одним миллилитром LTB four.

Затем с его помощью медленно наполните микропипетку сверху, прикрепите трубку к четырехнаполненной микропипетке LTB. Затем подсоедините микропипетку и трубку к игле 21 калибра в полтора дюйма, прикрепленной к одномиллилитровому шприцу, также заполненному лигандом. Теперь аккуратно закрепите наполненную лигандом микропипетку на одном из микроманипуляторов на предметном столике микроскопа, чтобы выполнить визуализацию дендритных клеток, полученных из костного мозга, в живых клетках.

В ответ на применение четвертого лиганда LTB извлеките из инкубатора покрытые незрелые b MDC и поместите их на нагретый предметный столик микроскопа. Обратите внимание на клетки с помощью 60-кратной масляной иммерсионной линзы. Найдите область, в которой клетки не слишком скучены, чтобы можно было должным образом контролировать миграцию.

Снимите крышку с флюоротарной формы. Затем с помощью грубого ручного манипулятора осторожно опустите нагруженную лигандом пипетку и введите ее внутрь. Закрывает близость к ячейкам с помощью гидравлического мелкодисперсного микроманипулятора.

Сфокусируйте дозатор. Приложите небольшое давление от шприца, чтобы инициировать медленное высвобождение четвертого лиганда LTB с наконечника, лиганд должен медленно распространяться в среду путем диффузии. Затем, используя программное обеспечение metamorph, установите параметры получения изображения для получения светлого поля каждые 15 секунд в течение двух часов.

Каждые пять минут следите за прогрессированием миграции в сторону лиганда. Метод, описанный в этом протоколе, был использован для определения миграции дендритных клеток в сторону лейкотриена B 4. В этом случае миграция дендритных клеток из костного мозга мыши достигала 100.

Нан Животное или LTB четыре виден, это видео замедленной визуализации показывает живую миграцию клеток B MDC в сторону LTB. Четыре подобных метода могут быть применены для определения хемотаксического ответа многих типов клеток на различные химиоаттрактанты. Этот тип визуализации в сочетании с молекулами флуоресцентных белковых меток может быть использован для отслеживания движений и взаимодействий молекул в режиме реального времени в живых клетках.

Здесь мы демонстрируем взаимодействие флуоресцентной метки лейкотриена B 4 рецептора один с бета-аррестином в режиме реального времени. RBL two H three — это линия клеток базофильного лейкоза крыс, выделенная из крыс Wister, которая может быть получена из A TCC. Эти клетки не экспрессируют многие хемокиновые рецепторы, но имеют клеточные компоненты, опосредующие хемокин-зависимые сигнальные пути.

Для оценки индуцированной лигандом интернализации BT one в реальном времени RBL two H три клетки трансфицируют BT one RFP и бета-арест в GFP. Во время покадровой визуализации в пластину добавляется лиганд. Изменения в локализации этих белков можно оценить с помощью анализа изображений.

Изучить интернализацию G ПЦР R в режиме реального времени трансфектировать B LT один RFP и бета-арест и GFP в RBL two H три клетки в соответствии с инструкцией в сопроводительном тексте. Затем перелейте 300 микролитров электропорированных ячеек и обычной смеси питательных сред в 35-миллиметровые фторсодержащие чашки, содержащие два миллилитра обычной питательной среды. Поместите клетки при температуре 37 градусов Цельсия во увлажненную атмосферу, состоящую на 95% из воздуха и на 5% из углекислого газа, чтобы они могли прилипнуть к дну посуды.

Через час замените среду для трансфекции обычной питательной средой и поместите клетки обратно в инкубатор еще на 18-24 часа. После инкубации промойте клетки два или три раза, добавив два миллилитра теплого фенил-красного свободного RPMI, содержащего 10 миллимоляров хиппи, непосредственно в тарелку и аспирируя среду. Затем добавьте еще 1,8 миллилитров.

Далее поместите чашку для культуры на нагретый предметный столик для микроскопа. Собирайте изображения с 600-кратным увеличением с помощью 60-кратного масляного иммерсионного объектива. Затем переключитесь на соответствующий флуоресцентный фильтр.

Выберите здоровую клетку, которая экспрессирует HBL BT один RFP на поверхности клетки, и захватите здесь изображение. С помощью переключателя фильтра RFP на фильтр GFP убедитесь, что бета-арест и GFP экспрессируются в цитоплазме, и захватите изображение. Затем изучите объединенные псевдоцветные изображения, чтобы убедиться, что они просачиваются через флуоресценцию, которая может возникнуть в результате тумана.

Нацеливание на рецепторы не происходит между RFP и GFP. Далее введите здесь параметры для покадровой съемки. 16-битные изображения получаются с параметром «Изгиб камеры», установленным в положение «Одно за другим».

Красные и зеленые флуоресцентные изображения последовательно захватываются с помощью фильтров RFP и GFP с помощью брызг луча R-F-P-G-F-P. Настройте программное обеспечение на захват изображений с 32-м интервалом времени в течение одного часа. Установите время экспозиции камеры таким образом, чтобы получить схожие динамические диапазоны.

Для интенсивности флуоресценции RFP и GFP. Собираем изображения в течение одной минуты, затем при t равно нулю. Добавьте 200 микролитров лиганда непосредственно в пластину, не нарушая ее.

Продолжайте собирать флуоресцентные изображения в течение 60 минут. После добавления лиганда, по мере получения изображений, они будут автоматически сохраняться в виде изображений TIFF с последовательными именами файлов. Затем файлы можно просматривать как отдельные или объединенные изображения с помощью программного обеспечения.

Наконец, после того, как все изображения ячеек были получены, получите изображения на обычном носителе без ячеек с теми же настройками. Сохраните файлы для использования в качестве фоновых изображений для анализа изображений. Используйте функцию вычитания изображений в метаморфе, чтобы вычесть фон из фактических данных, полученных выше.

Это позволит учесть любой фон или автофлуоресценцию от среды. Затем в меню «Файл» откройте опцию «Окончательный сгенерированный файл стека» и откройте отдельные стеки изображений. Затем в разделе «Измерения области» выберите область следа затмения и нарисуйте интересующие области, выберите поверхностные и цитозольные области для измерения интенсивности флуоресценции RFP и GFP, соответствующей транслокации BLT one и бета-аррестина.

С помощью опции log data, которая автоматически связывается с Excel, можно определить количество интенсивностей флуоресценции в зависимости от времени. Этот график предоставит информацию о кинетике транслокации данной молекулы. На снимке анализа можно выявить локализацию G, ПЦР, R и цитозольных белков и ядер.

Здесь видна экспрессия BT one RFP на поверхности RBL two H three cell. На этом изображении показана локализация бета-покоя и GFP в цитозоле той же клетки, и здесь p nuke CFP виден в ядре. Показанное здесь цветное комбинированное изображение указывает на отчетливую клеточную локализацию каждого флуорохромного лиганда, индуцированное взаимодействием поверхностных GPCR с цитозольным белком.

Лиганд индуцировал транслокацию рецептора BLT one и бета-аррестина. В этом видео показана живая визуализация клетки, экспрессирующей B LT one RFP и бета-арестин GFP. При добавлении одного микромолярного LTB четырех можно контролировать количественную оценку паттернов транслокации с помощью программного обеспечения метаморфа.

Линейное сканирование интенсивностей флуоресценции в репрезентативной клетке показано при Т, равном нулю. BT one RFP наблюдается на мембране, а бета-арест в GFP наблюдается в цитозоле. При добавлении лиганда наблюдается перекрытие линий RFP и GFP, что свидетельствует о колокализации рецептора и бета-аррестина.

Кроме того, здесь можно определить кинетику движения белка. Кинетика интернализации рецепторов и транслокации бета-аррентина. При добавлении одного микромоляра ЛТБ исследовали четыре.

Интенсивность флуоресценции измеряли в зависимости от времени в мембранных и цитозольных местах клетки: добавление четвертого лиганда LTB к B LT одному RFP и бета-арестину одного GFP Трансфицированный RRB two H три клетки приводит к транслокации бета-арестина one GFP из цитозоля в мембрану, наблюдаемой как образование желтого кольца в течение одной минуты. При взаимодействии с бета-аррестином одного GFP, BT one RFP образует рецепторный комплекс бета-аррестина одного GFP и транслоцируется через цитозоль в виде эндосом, о чем свидетельствует появление желтых точек в течение пяти минут. С помощью этих методов можно определить статус активации лиганд-зависимого рецептора и критические мотивы или процессы, участвующие в активации рецептора.

Самое важное в эксперименте — следить за буфером в планшете во время его работы. Так как эксперимент выходит за рамки одного часа после его разработки. Эта методика появилась у исследователей в области хемокинов и рецепторов для изучения миграции оката и взаимодействия рецепторных лигандов в различных типах клеток млекопитающих.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить эксперименты с визуализацией в реальном времени с участием хемокинов и их рецепторов, а также их взаимодействия с цитозольными белками, такими как бета-рестрикции.