В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B ₄ Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin

Лейкотриен B4 представляет собой провоспалительную молекулу, которая реализует свое действие через G-белоксопряженные рецепторы BLT1 и BLT2 на различных воспалительных клетках. Было показано, что путь LTB4—BLT1 играет критическую роль при ряде воспалительных заболеваний, включая астму, артрит и атеросклероз. G-белоксопряженные рецепторы (GPCR) опосредуют трансдукцию внеклеточных сигналов, которые вызывают внутриклеточные ответы, такие как хемотаксис, высвобождение внутриклеточного кальция и регуляция экспрессии генов.

Связывание внеклеточного лиганда вызывает серию конформационных изменений, которые приводят к активации гетеротримерных G-белков. G-белки затем модулируют уровни вторичных посредников, таких как циклический аденозинмонофосфат, аденозинтрифосфат и диацилглицерин. Для мониторинга миграции клеток, опосредованной лейкотриеном B4, в режиме реального времени проводится визуализация дендритных клеток костного мозга (BMDCs) при подаче лиганда через контролируемый поток из микропипетки. Для оценки миграции используется тайм-лапс визуализация.

Используя эти методы визуализации живых клеток в режиме реального времени, наша лаборатория обнаружила, что рецептор лейкотриена B4, BT1, функционально экспрессируется на дендритных клетках. Мы также выявили механизмы интернализации BT1, зависящие от фосфорилирования и бета-аррестина. Доктор Джла, ассистент профессора в нашей лаборатории, разработавшая многие из этих методов, продемонстрирует как миграцию живых клеток, так и интернализацию рецепторов. Для подготовки дендритных клеток костного мозга (BMDCs) для анализов клеточной миграции высейте 0,5 миллиона клеток в культуральную среду RPMI 1640, содержащую FBS, рекомбинантный GM-CSF и рекомбинантный FLT3, в чашку с стеклянным дном диаметром 35 мм.

После посева инкубируйте клетки в течение 16 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide. Через 16 часов добавьте 3 мл PBS, затем аспирируйте. Повторите эту промывку еще минимум два раза; после последнего аспирирования добавьте в лунку 2 мл PBS.

Теперь клетки готовы к эксперименту; их следует содержать при температуре 37 °C. Система визуализации, используемая в экспериментах в данном видео, состоит из эпифлуоресцентной системы A-T-E-F-M, установленной на инвертированном микроскопе Nikon eclipse TE 300, который оснащен термостатом для предметных стекол и охлаждаемой черно-белой CCD-камерой SNAP hq.

Длины волн возбуждения и эмиссии регулируются с помощью колес фильтров и контроллера колес фильтров Lambda 10-2. Управление оборудованием и получение изображений осуществляется с помощью программного обеспечения Metamorph. К предметному столику микроскопа прикреплены два микроманипулятора для удержания пипеток, которые можно либо изготовить самостоятельно согласно инструкциям в сопроводительном тексте, либо приобрести готовыми.

Перенесите 1,5 мл стокового раствора провоспалительного лиганда лейкотриена B4 (LTB4) с концентрацией 100 нМ в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Выполните предварительное заполнение микропипетки, погрузив наконечник в раствор и дав жидкости подняться; такой способ загрузки предотвратит образование пузырьков воздуха на конце микропипетки. Затем наберите 1 мл LTB4 в туберкулиновый шприц объемом 1 см³, оснащенный иглой Microfill.

Затем используйте его, чтобы медленно заполнить микропипетку сверху, прикрепив трубку к LTB. После заполнения микропипетки подсоедините её и трубку к игле калибра 21 G длиной 1,5 дюйма, прикрепленной к одномиллилитровому шприцу, также заполненному лигандом. Теперь осторожно закрепите заполненную лигандом микропипетку в одном из микроманипуляторов на предметном столике микроскопа для проведения прижизненной визуализации дендритных клеток костного мозга.

После добавления лиганда LTB четыре извлеките планшет с незрелыми b MDCs из инкубатора и поместите его на подогреваемый предметный столик микроскопа. Найдите клетки, используя иммерсионный объектив с увеличением 60 x. Выберите область, где клетки расположены не слишком плотно, чтобы можно было надлежащим образом отслеживать их миграцию.

Снимите крышку с флуоресцентной чашки. Затем с помощью грубого ручного манипулятора осторожно опустите пипетку с лигандом и подведите её в непосредственную близость к клеткам, используя гидравлический прецизионный микроманипулятор.

Настройте фокус пипетки. Слегка надавите на шприц, чтобы начать медленное высвобождение лиганда LTB four из кончика; лиганд должен медленно распространяться в среде путем диффузии. Затем с помощью программного обеспечения Metamorph установите параметры сбора данных для получения изображения в светлом поле каждые 15 секунд в течение двух часов.

Продолжайте проводить мониторинг каждые пять минут для отслеживания прогрессирования миграции к лиганду. Метод, описанный в данном протоколе, использовался для определения миграции дендритных клеток к лейкотриену B4. В данном случае изучалась миграция дендритных клеток костного мозга мыши к 100.

В данном видео с таймлапс-съемкой показана миграция живых клеток B MDCs в сторону LTB4. Аналогичные методы могут быть применены для определения хемотаксического ответа многих типов клеток на различные хемоаттрактанты. Этот тип визуализации в сочетании с молекулами флуоресцентных белковых меток может быть использован для отслеживания перемещений и взаимодействий молекул в живых клетках в режиме реального времени.

Здесь мы демонстрируем взаимодействия флуоресцентно меченого рецептора лейкотриена B4 1 с бета-аррестином в режиме реального времени. RBL 2H3 — это линия базофильных лейкозных клеток крысы, выделенная из крыс линии Wister, которую можно приобрести в ATCC. Эти клетки экспрессируют немного хемокиновых рецепторов, но обладают клеточными компонентами, необходимыми для обеспечения хемокин-зависимых сигнальных путей.

Для оценки индуцированной лигандом интернализации BT1 в режиме реального времени клетки RBL-2H3 трансфецируют BT1-RFP и бета-аррестином-GFP. В процессе таймлапс-визуализации в планшет добавляют лиганд. Изменения в локализации этих белков могут быть оценены с помощью анализа изображений.

Для изучения интернализации G PCR R в режиме реального времени трансфецируйте B LT one RFP и бета-аррестин GFP в клетки RBL two H three согласно инструкциям в сопроводительном тексте. Затем перенесите смесь 300 µL электропорированных клеток и регулярной ростовой среды в 35-мм флуоресцентные чашки, содержащие 2 mL регулярной ростовой среды. Поместите клетки при 37 °C в увлажненную атмосферу из 95% воздуха и 5% carbon dioxide, чтобы они прикрепились к дну чашки.

Через один час замените среду для трансфекции обычной ростовой средой и верните клетки в инкубатор еще на 18–24 часа. После инкубации промойте клетки два или три раза, добавляя по 2 мл теплого раствора RPMI без фенолового красного, содержащего 10 мМ HEPES, непосредственно в планшет, с последующим аспирированием среды. Затем добавьте еще 1,8 мл.

Затем поместите чашку Петри на подогреваемый предметный столик микроскопа. Сделайте снимки при 600-кратном увеличении, используя иммерсионный объектив 60 x. После этого переключитесь на соответствующий флуоресцентный фильтр.

Выберите здоровую клетку, на поверхности которой экспрессируется HBL BT one RFP, и сделайте снимок. Используя RFP-фильтр, переключитесь на GFP-фильтр, убедитесь, что бета-аррестин и GFP экспрессируются в цитоплазме, и сделайте снимок. Затем изучите совмещенные псевдоцветные изображения, чтобы убедиться в отсутствии перекрестного загрязнения флуоресценции (bleed-through), которое может возникнуть вследствие ошибки.

Таргетинг рецепторов между RFP и GFP не происходит. Далее введите здесь параметры для таймлапс-визуализации. 16-битные изображения регистрируются камерой с настройкой последовательного сканирования (one by one).

Изображения красной и зеленой флуоресценции последовательно регистрируются с использованием фильтров для RFP и GFP с помощью разделителя пучка R-F-P-G-F-P. Настройте программное обеспечение на захват изображений с интервалом в 32 секунды в течение одного часа. Установите время экспозиции камеры таким образом, чтобы получить схожие динамические диапазоны.

Для измерения интенсивности флуоресценции RFP и GFP. Выполните сбор изображений в течение одной минуты, затем в момент t = 0. Добавьте 200 µL лиганда непосредственно в планшет, не создавая в нем возмущений.

Продолжайте сбор флуоресцентных изображений в течение 60 минут. После добавления лиганда получаемые изображения будут автоматически сохраняться в формате TIFF с последовательными именами файлов. Впоследствии эти файлы можно просматривать с помощью программного обеспечения как отдельные или комбинированные изображения.

Наконец, после получения всех изображений клеток, сделайте снимки чистой среды без клеток, используя те же настройки. Сохраните эти файлы для использования в качестве фоновых изображений при анализе. Используйте функцию вычитания изображений в программе Metamorph, чтобы вычесть фон из полученных выше фактических данных.

Это позволит учесть любой фоновый сигнал или автофлуоресценцию среды. Затем в меню «Файл» (file menu) выберите опцию открытия финального сгенерированного стекового файла (final generated stack file) и откройте отдельные стеки изображений. Далее в разделе измерений области (region measurements) выберите функцию трассировки области эллипса (ellipse region trace region) и обведите интересующие области; выберите поверхностные и цитозольные области, чтобы измерить интенсивность флуоресценции RFP и GFP, соответствующие BLT 1 и транслокации бета-аррестина.

Используя опцию записи данных, которая автоматически связывается с Excel, постройте график зависимости интенсивности флуоресценции от времени. Этот график предоставит информацию о кинетике транслокации данной молекулы. Анализ изображений позволяет определить локализацию G PCR R, цитозольных белков и белков ядра.

Здесь видна экспрессия BT1-RFP на поверхности клетки RBL2 H3. На этом изображении показана локализация beta-arrestin и GFP в цитозоле той же клетки, а также pNuke-CFP в ядре. Представленное комбинированное цветное изображение демонстрирует отчетливую клеточную локализацию каждого флуорохрома; здесь также может быть оценено индуцированное лигандом взаимодействие поверхностных GPCR с цитозольными белками.

Лиганд-индуцированная транслокация рецептора BLT1 и бета-аррестина. В данном видео продемонстрирована прижизненная визуализация клетки, экспрессирующей BLT1 RFP и бета-аррестин GFP. После добавления 1 µM LTB4 количественный анализ паттернов транслокации можно проводить с помощью программного обеспечения MetaMorph.

На рисунке показан линейный скан интенсивности флуоресценции в репрезентативной клетке в момент времени T = 0. β1 RFP локализуется на мембране, а бета-аррестин GFP — в цитозоле. После добавления лиганда наблюдается перекрытие линий RFP и GFP, что свидетельствует о колокализации рецептора и бета-аррестина.

Кроме того, здесь можно определить кинетику перемещения белков. Кинетика интернализации рецептора и транслокации бета-аррестина была изучена после добавления 1 µM LTB4.

Интенсивность флуоресценции измеряли в зависимости от времени в мембранных и цитозольных областях клетки. Добавление лиганда LTB₄ к клеткам RRB2 H3, трансфектированным BLT1 RFP и β-arrestin-1 GFP, приводит к транслокации β-arrestin-1 GFP из цитозоля к мембране, что проявляется в виде образования желтого кольца в течение одной минуты. При взаимодействии с β-arrestin-1 GFP белок BLT1 RFP образует комплекс рецептора с β-arrestin-1 GFP и перемещается через цитозоль в виде эндосом, что подтверждается появлением желтых puncta в течение пяти минут. С помощью этих методов можно определить статус лиганд-зависимой активации рецептора, а также критические мотивы или процессы, участвующие в активации рецептора.

Самым важным аспектом в данном эксперименте является контроль уровня буфера в планшете в процессе работы. Это особенно актуально, поскольку эксперимент продолжается более одного часа после начала его проведения. Данный метод был разработан исследователями в области хемокинов и их рецепторов для изучения миграции клеток и взаимодействий рецепторов с лигандами в различных типах клеток млекопитающих.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как организовать эксперименты по визуализации в реальном времени с участием хемокинов, их рецепторов и их взаимодействий с цитозольными белками, такими как бета-аррестины.