Строительство Лучше Mosquito: Идентификация генов Включение малярия и лихорадка денге Сопротивления в gambiae А. и А. aegypti комаров

Я Джордж Димопулос, доцент кафедры молекулярной микробиологии и иммунологии Школы общественного здравоохранения Университета Джонса Хопкинса в Исследовательском институте малярии. Моя исследовательская группа работает с комарами Anopheles gambiae, переносящими малярию; мы изучаем молекулярную биологию комара, уделяя особое внимание врожденной иммунной системе насекомого, которая участвует в уничтожении паразитов малярии.

Мы стремимся понять, как функционирует эта иммунная система, и определить, какие гены и молекулы играют важную роль в уничтожении паразита. Мы полагаем, что понимание биологии этой системы позволит нам использовать полученные знания для разработки стратегий борьбы с малярией в будущем. Малярия является одним из самых серьезных заболеваний в мире.

Малярия сопровождает человечество на протяжении всей его истории, и прискорбно, что она до сих пор существует. Ежегодно малярией заражаются 400 миллионов человек, и она становится причиной смерти 2 миллионов людей, преимущественно в регионе Африки к югу от Сахары, однако заболевание встречается и в других развивающихся странах Южной Америки и Азии. Малярия вызывается простейшим паразитом рода Plasmodium, при этом существует четыре вида Plasmodium, способных вызывать малярию у людей.

Наиболее важным из них является Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum переносится преимущественно комарами рода Anopheles; при этом наиболее значимыми переносчиками малярии в странах Африки к югу от Сахары являются представители видового комплекса Anopheles gambiae, которые распределены главным образом в этом регионе. Вирус денге представляет собой флавивирус и переносится преимущественно комаром Aedes aegypti.

Его географическое распределение весьма схоже с распределением малярии. Вирус встречается в Америке, Юго-Восточной Азии и Африке. Вирус денге вызывает геморрагическую лихорадку.

Приблизительно 2,5 миллиарда человек подвержены риску заражения вирусом денге, который ежегодно вызывает геморрагическую лихорадку у миллионов людей. За последние 10 лет геморрагическая лихорадка денге стала одним из наиболее серьезных трансмиссивных заболеваний. Аналогично, паразит малярии имеет сложный жизненный цикл, протекающий как в переносчике — комаре, который осуществляет передачу вируса, так и в организме человека.

Моя исследовательская группа изучает биологию передачи малярии комарами. Когда комар заглатывает зараженную порцию крови, он также заглатывает паразитов Plasmodium falciparum. Гаметоциты паразита оплодотворяются в средней кишке и образуют ookinete примерно через 18–35 часов после заглатывания крови.

Эти ookinetes должны проникнуть в эпителий кишечника комара здесь. Большинство ookinetes уничтожается иммунной системой комара на данном этапе, и именно на этом процессе сосредоточены наши исследования; здесь также представлено изображение ookinetes, полученное с помощью конфокальной микроскопии. Те ookinetes, которым удастся преодолеть среднюю кишку, сформируют здесь кисту на базальной стороне, и внутри этой кисты разовьются тысячи паразитов на стадии sporozoite. Эти стадии sporozoite примерно через 15 дней после того, как комар принял порцию крови, мигрируют в слюнные железы, и из слюнных желез sporozoites могут быть переданы новому хозяину. Иммунная система комара также участвует в уничтожении sporozoites на этом этапе, когда они высвобождаются в гемоцель комара.

Геном комара был секвенирован в 2002 году, что позволило нам разработать новые инструменты молекулярной биологии и геномики для изучения экспрессии всех генов комара — примерно 14 000 генов — при различных условиях инфекции с помощью так называемых микрочипов. Этот микрочип, который мы разработали несколько лет назад, содержит весь транскриптом комара, включая все известные на тот момент гены комара, а также гены паразита Plasmodium. Таким образом, мы можем одновременно анализировать активность генов как комара, так и паразита в процессе инфекции.

После выявления генов, которые активируются при инфицировании комара паразитами рода Plasmodium, нам необходимо проверить, участвуют ли эти гены в уничтожении паразита. Мы делаем это с помощью метода, называемого РНК-интерференцией (сайленсингом генов). По сути, мы вводим РНК, соответствующую генам-мишеням; эта двухцепочечная РНК вызывает деградацию мРНК целевых генов комара, в результате чего данные гены перестают синтезировать белок. Затем мы инфицируем комара паразитом.

Теперь, если мы подавили экспрессию или инактивировали определенный ген у комара, и в результате этого сайленсинга паразит может вызвать более сильную инфекцию, чем обычно у необработанных комаров, это будет указывать на то, что данный ген каким-то образом участвует в уничтожении малярийных паразитов. И это основной метод, который мы используем для проверки того, задействованы ли гены в уничтожении паразитов в организме комара.

Большинство паразитов plasmodium погибают в организме комара, и мы располагаем вескими доказательствами того, что за это уничтожение в основном отвечает врожденная иммунная система комаров. Наша лаборатория и лаборатории наших коллег идентифицировали ряд генов, участвующих в этом процессе уничтожения. Также существуют генетически селекционированные штаммы комаров, которые не передают малярию, поскольку уничтожают всех паразитов в средней кишке с помощью механизмов врожденного иммунитета.

Похоже, что комар обладает разнообразными компонентами и механизмами для борьбы с паразитом, и главной задачей на сегодняшний день является понимание принципов работы этих функций и способов их манипулирования для выведения резистентных комаров. Комар GTI использует иные механизмы контроля инфекции вируса денге, чем комар Anopheles gambiae при контроле инфекции Plasmodium ovale. Комар Aedes aegypti, как и все эукариоты, обладает РНК-зависимым защитным механизмом, называемым РНК-интерференцией.

По сути, это защитный механизм, способный нацеливаться на РНК вируса для ее деградации, таким образом защищая организм от вирусной инфекции. Мы пытаемся понять этот механизм защиты и выяснить, как им можно манипулировать для создания комаров, устойчивых к вирусу. За последние 10 лет молекулярная биология претерпела значительный прогресс, главным образом в области методологии, что колоссально ускорило наши исследования.

Одним из основных достижений стали технологии секвенирования, которые позволили осуществлять высокопроизводительное секвенирование целых геномов. Благодаря этим технологиям на сегодняшний день полностью секвенированы геномы комаров ous Gambia и A, this gyp. Это позволяет нам гораздо проще, чем раньше, идентифицировать гены, участвующие в контроле инфекций.

Другим очень важным достижением в области функциональной геномики является высокопроизводительный анализ экспрессии генов с использованием микрочипов. Микрочипы представляют собой небольшие стеклянные предметные стекла, на которых иммобилизованы тысячи фрагментов ДНК; с помощью этих так называемых ДНК-чипов можно контролировать экспрессию очень большого количества генов. Еще одним крайне важным достижением в данной области является методика сайленсинга генов с помощью РНК-интерференции, которая позволяет прицельно воздействовать на гены и инактивировать их у комара, используя таким образом так называемый подход обратной генетики для изучения функции генов и того, какую роль интересующие нас гены играют в уничтожении паразита.

Комары, на которых мы и наши коллеги провели большинство этих исследований, происходят из лабораторных колоний, которые содержались в контролируемых условиях на протяжении почти 30 лет. Очевидно, что эти комары значительно отличаются от тех, которых мы встречаем в природе. Дикие комары находятся под постоянным селективным давлением различных микробов и других факторов, которые в полевых условиях сильно варьируются по сравнению с довольно стабильными условиями в нашей лаборатории.

Таким образом, можно утверждать, что наши исследования, вероятно, были бы гораздо более информативными, если бы они проводились непосредственно на диких комарах. К сожалению, это сделать не так просто. Как уже было сказано, у нас нет соответствующей инфраструктуры в полевых условиях, кроме того, сбор диких комаров и создание из них лабораторных колоний является очень сложным процессом.

Таким образом, лучшими биологическими моделями, доступными сегодня, являются лабораторные модели, однако в определенный момент нам, безусловно, придется выйти в полевые условия, чтобы проверить и подтвердить основные результаты, полученные в ходе исследований на наших лабораторных комарах. Мы знаем, что системы защиты комаров участвуют в уничтожении патогенов человека, которые переносятся этими насекомыми. Если мы сможем понять, как происходит это уничтожение, какие гены и механизмы в этом задействованы, мы потенциально сможем ими манипулировать и использовать эту возможность для создания генетически модифицированных комаров, неспособных переносить патоген.

После разработки таких генетически модифицированных комаров можно приступить к рассмотрению способов их фактического внедрения в природную среду и обеспечения их доминирования над восприимчивыми особями. Одной из широко обсуждаемых стратегий достижения этой цели является распространение в естественных популяциях генов резистентности, которые делают комаров устойчивыми к патогенам; это должно быть реализовано с помощью так называемых механизмов генного драйва. В настоящее время значительная часть исследований сосредоточена на разработке таких механизмов генного драйва.

Безусловно, существует множество этических аспектов, которые необходимо учитывать при выпуске любого типа генетически модифицированных организмов в природу. Важно помнить, что генетические модификации постоянно происходят в естественных условиях. Нет веских оснований полагать, что в результате трех мутаций мы получим комара, который будет эффективнее переносить патоген или будет обладать какими-либо иными нежелательными характеристиками.

Худшее, что могло бы произойти, — это развитие у патогена устойчивости к этому трансгенному комару; разумеется, нам потребуется провести множество полевых и лабораторных испытаний, прежде чем мы задумаемся о выпуске генетически модифицированного комара в естественную среду. Также нам необходимо будет проинформировать людей об этих методах контролируемого воздействия и убедиться, что все чувствуют себя комфортно и поддерживают подобную стратегию. На нашем пути все еще стоит множество препятствий для реализации стратегии борьбы с заболеванием, основанной на блокировании патогена в комаре-переносчике.

Некоторые из этих препятствий связаны с техническими и экспериментальными проблемами, которые нам необходимо решить. Одним из таких препятствий, например, является разработка механизмов генного драйва — механизмов, которые позволили бы этим генам устойчивости эффективно распространяться в популяциях. В последние 10–15 лет в области биологии переносчиков заболеваний произошел стремительный прогресс, главным образом благодаря признанию того, что понимание биологии взаимодействия насекомых с патогенами может фактически помочь нам в разработке стратегий контроля.

Это признание привело к увеличению финансирования исследований в данной области. Чрезвычайно важно, чтобы это финансирование и поддержка продолжались, чтобы мы могли сохранить достигнутый темп и выполнить нашу миссию, изучив биологию взаимодействия переносчика и патогена, а также то, как мы можем использовать эти биологические особенности для разработки стратегий по борьбе с заболеваниями.