Экологически индуцированные наследственные изменения в Лен

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать метод выращивания индуцибельного сорта льна в условиях, приводящих к возникновению наследуемой геномной вариабельности. Кроме того, осуществляется мониторинг геномных изменений и наблюдается рост индуцированных растений в последующих поколениях в различных условиях окружающей среды. Для достижения этой цели лен выращивают при различных индуцирующих условиях.

Затем в разные периоды роста растений в различных условиях среды собирают образцы тканей листьев и стеблей Maris. Далее из образцов тканей выделяют ДНК и РНК. Заключительным этапом процедуры является проведение ПЦР с использованием образцов ДНК и ОТ-КПЦР с использованием выделенной РНК для выявления геномных изменений и изменений экспрессии генов, возникших в результате роста в различных условиях окружающей среды.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие геномный ответ на условия роста, с появлением одного инсерционного элемента LIS в определенной точке генома, а также различия в экспрессии, связанные с наличием этого элемента, что визуализируется с помощью ПЦР и ОТ-ПЦР, проведенных с использованием нуклеиновых кислот, выделенных из тканей обработанных растений. Здравствуйте, я Крис Калл с кафедры биологии Университета Кейс Вестерн Резерв. А я Кори Джонсон из лаборатории Калла.

А я Тиффани Мосс, также из лаборатории Калла. А я Маршалл Лукас, студент программы летних исследований для бакалавров в лаборатории Калла.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения изменений в геноме и экспрессии генов, вызванных вариациями условий роста. Итак, приступим. Чтобы вырастить лен в условиях индукции, начните с заполнения пятидюймовых горшков почвой и ее уплотнения.

Затем высадите по три семени льна в каждый горшок на глубину одной четверти дюйма. Затем засыпьте семена почвой для создания условий неиндуцированного контроля. Полейте растения 100 миллилитрами раствора Miracle-Gro в десятикратном разведении.

Обработайте растения в условиях высокого содержания питательных веществ, добавив 100 мл полноконцентратного раствора Miracle grow. В завершение нанесите.

Растения с низким содержанием питательных веществ поливали только водопроводной водой. В течение лета по мере роста растения выращивали при естественном освещении. Все растения поливали с помощью автоматической системы распыления дважды в день по пять минут.

Раз в неделю обеспечивайте растениям необходимые условия для роста. Собирайте листья и стебли с недельным интервалом. Для экстракции ДНК собирают шесть листьев, а для экстракции РНК требуются три стебля. После сбора поместите растительный материал в криопробирку, быстро заморозьте его в жидком азоте и храните образцы при температуре -80 °C до проведения экстракции.

Три генотипа растут с разной относительной скоростью в зависимости от условий. В контрольных условиях лучше всего растет инбредный сорт льна storm или линия PL. На основе этого родительского растения были получены несколько линий, при этом крупносемянный или L-сорт отличается большей жизнеспособностью, чем мелкосемянный или S-сорт.

Однако при низком содержании питательных веществ S растет лучше, чем L или pl. А в условиях высокого содержания питательных веществ L растет лучше, чем pl, который растет лишь немного лучше S. Сравнение каждой из линий, выращенных при трех различных режимах обработки, показывает, что PL растет лучше всего в контрольных условиях. L растет лучше всего в условиях высокого содержания питательных веществ, а S растет примерно одинаково как при высоком содержании питательных веществ, так и в контрольных условиях.

Эти данные показывают, что три линии могут быть дифференцированы на основании их роста в трех различных средах. В то время как PL и L растут лучше в специфических условиях, S растет примерно одинаково во всех трех вариантах. Линия S не способна извлечь выгоду из улучшенных условий питания, но при этом лучше растет в условиях крайне низкого содержания питательных веществ.

Для экстракции ДНК добавьте буфер AP1 из набора Qiagen DNeasy Plant DNA Prep в микроцентрифужную пробирку с шестью листьями и стерильным песком, затем перетрите ткань микропестиком до полного исчезновения комочков. Продолжите экстракцию согласно инструкции к набору. Для начала экстракции РНК перенесите три стебля *Maris* с прилегающими листьями из криопробирки для хранения в микроцентрифужную пробирку. Добавьте в пробирку стерильный песок и перетрите ткань микропестиком до получения однородной массы.

Перемешайте образец на вортексе в течение 15 секунд для облегчения лизиса, затем центрифугируйте одну минуту при 13 000 RPM для осаждения песка и любых остаточных частиц. Перенесите супернатант в спин-колонку и продолжите выделение РНК в соответствии с инструкциями производителя. После экстракции РНК из ткани добавьте в реакционную смесь 10 XDNA буфер в объеме, составляющем 1/10 от объема образца РНК.

Добавьте 30 единиц DNase, затем инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 30 минут, после чего при 70 °C в течение пяти минут. Проведите обратную транскрипцию с использованием набора Applied Biosystems RNA to cDNA. Согласно инструкциям производителя, инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение одного часа, а затем при 95 °C в течение пяти минут.

Наконец, нанесите 5 µL кДНК на 1,5% Арос-гель для определения выхода. После подготовки кДНК льна её используют для количественной ПЦР. Проведите количественную ПЦР с использованием системы ABI StepOne.

Проводите все анализы в трех повторностях для каждого запуска; используйте ген домашнего хозяйства Acton в качестве контроля числа копий при подготовке реакций для QPCR. Добавьте по одному микролитру соответствующей пары праймеров в каждую пробирку. Разведите CD NA до нужной концентрации и добавьте по девять микролитров в каждую пробирку.

Наконец, добавьте в каждую пробирку 10 µL двухкратной смеси PCR master mix с красителем cyberg green. Затем настройте программу амплификации в соответствии с протоколом. Рассчитайте относительные уровни экспрессии на основании порогового цикла, который определяется параметрами по умолчанию в программном обеспечении step one и подтверждается путем анализа кривых амплификации.

ПЦР-амплификация ДНК, выделенной из листьев в различных точках вдоль стебля, демонстрирует появление единичной копии фрагмента ДНК размером 5,7 килобаз, называемого последовательностью вставки линии, или LIS one, когда растения выращиваются в индуцирующих условиях. LIS one появляется, когда PL выращивают в условиях дефицита питательных веществ, и со временем становится гомозиготным. Здесь образцы листьев с первого по шестой отбирались с недельным интервалом, при этом образец один был получен самым ранним после посева; затем из образцов была экстрагирована ДНК.

ПЦР-амплификация выявляет наличие обоих концов LAS one во всех образцах, кроме первого. Это соответствует исчезновению сайта вставки unins и отсутствию его признаков при количественной ПЦР пятого листа. Результаты показывают, что наличие LAS one или другие геномные изменения, связанные с индукцией, влияют на экспрессию генов в непосредственной близости от S one.

Шесть представленных здесь генов дифференциально экспрессируются в PL и S; четыре из этих генов имеют более высокую экспрессию в pl, у которого отсутствует LIS one. И наоборот, два гена имеют более высокую экспрессию в S, у которого LIS one присутствует. Мы только что продемонстрировали вам способ выращивания индуцибельных линий льна. Таким образом, геном изменяется в ответ на условия среды выращивания и характеристики роста последующих поколений.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что для воспроизводимой индукции изменений необходимо повторить условия культивирования. На этом всё. Я знаю, что многие из вас скептически относятся к этому явлению, но теперь вы можете самостоятельно воспроизвести эти наблюдения.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.