Экологически индуцированные наследственные изменения в Лен

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать метод выращивания индуцируемого сорта льна в условиях, которые приводят к наследственной геномной изменчивости. Кроме того, отслеживаются геномные изменения и наблюдается рост индуцированных растений в последующих поколениях в различных условиях. Для этого лен выращивают в различных индуцирующих условиях.

Затем ткань листьев и стебля мариса собирается в разное время во время роста растений в различных условиях. Далее из образцов тканей выделяют ДНК и РНК. Заключительным этапом процедуры является проведение ПЦР с использованием образцов ДНК и Q-R-T-P-C-R с использованием выделенной РНК для выявления геномных изменений и изменений экспрессии генов, возникающих в результате роста в различных условиях окружающей среды.

В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие геномную реакцию на условия роста с появлением одного встраиваемого элемента LIS в определенной точке генома и различия в экспрессии, связанные с присутствием этого элемента, как это визуализировано с помощью ПЦР и R-T-P-C-R, выполненных с нуклеиновой кислотой, выделенной из тканей обработанных растений. Здравствуйте, меня зовут Крис Калл, я работаю на биологическом факультете Университета Кейс Вестерн Резерв. Меня зовут Кори Джонсон из лаборатории Кулла.

Меня зовут Тиффани Мосс, я тоже из лаборатории по выбраковке. А я Маршалл Лукас. Студент летней программы бакалавриата по исследованиям в лаборатории Кулла.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения изменений в геноме и экспрессии генов, возникающих в результате изменений в среде произрастания. Итак, приступим. Выращивание льна в индуцированных условиях начинается с заполнения пятидюймовых горшков почвой и укрепления.

Затем посадите, по три семени льна в горшке, глубиной в четверть дюйма. Затем из почвы над семенами для неиндуцирующих контрольных условий. Полейте растения 100 миллилитрами одного 10-го раствора чудо-выращивания.

Обрабатывайте растения в условиях с высоким содержанием питательных веществ 100 миллилитров полной концентрации. Чудо вырастить. Наконец, примените.

Только водопроводная вода для растений с низким содержанием питательных веществ. Выращивайте растения при естественном освещении в течение лета по мере роста растений. Поливайте все растения автоматической системой распыления два раза в день в течение пяти минут.

Применяйте условия роста к растениям раз в неделю. Собирайте листья в стебли мари с интервалом в неделю. Шесть листьев собираются для экстракции ДНК, а для экстракции РНК необходимы три стебля, после сбора помещают растительный материал в криопробирку, быстро замораживают его в жидком азоте и хранят образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до извлечения.

Три генотипа растут с разной относительной скоростью в зависимости от условий. В контрольных условиях лучше всего растет инбредный сорт льна Шторм или линия PL. Несколько линий были выведены от этого родителя, причем большая или L-сорт была более энергичной, чем мелкая или S-разновидность.

Однако при низком содержании питательных веществ S растет лучше, чем L или pl. А в условиях с высоким содержанием питательных веществ L растет лучше, чем PL, который растет лишь немного лучше, чем S. Сравнение каждой из линий, выращенных при трех различных обработках, показывает, что PL лучше всего растет в контрольных условиях. L лучше всего растет в условиях с высоким содержанием питательных веществ, а S одинаково растет как в условиях с высоким содержанием питательных веществ, так и в контрольных условиях.

Эти данные показывают, что эти три линии могут быть дифференцированы на основе их роста в трех средах. В то время как PL и L лучше растут в определенных условиях, S растет примерно одинаково во всех трех условиях. S не способен использовать преимущества улучшенных питательных условий, но лучше способен расти в условиях очень низкого содержания питательных веществ.

Для извлечения ДНК добавьте буфер, AP один из Qiagen, DNEZ plant, набор для подготовки ДНК к шести листьям со стерильным песком в микропробирке, измельчите ткань микропестиком до тех пор, пока не будут видны комки. Продолжайте экстракцию, следуя инструкциям набора, чтобы начать перенос экстракции РНК, трех стеблей мариса и нескольких окружающих листьев из криопрошина для хранения в микропробирку. Добавьте в трубку стерильный песок и измельчите ткань с помощью микропестика до мелкого помола.

Сделайте образец вихревым в течение 15 секунд, чтобы облегчить лизис, затем вращайте в течение одной минуты со скоростью 13 000 об/мин, чтобы собрать песок и любой мусор. Добавьте SNAT в спиновую колонку и продолжайте подготовку РНК в соответствии с инструкциями производителя. После того, как РНК экстрагирована из ткани, передайте 10 буферов XДНК на одну 10-ю часть объема образца РНК в реакцию.

И при 30 единицах D Ns инкубируйте реакцию при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, а затем при 70 градусах Цельсия в течение пяти минут. Проведите обратную транскрипцию с помощью набора прикладных биосистем РНК к CD NA. В соответствии с инструкциями производителя и S, инкубируйте реакцию при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, а затем при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.

Наконец, нанесите пять микролитров CDNA на 1,5% гель AROS, чтобы определить выход. После того, как лен CD NA получен, его используют для QPCR. Проведите QPCR с помощью системы A BI Step one.

Выполняйте все анализы в трех экземплярах для каждого прогона и используйте бытовой Gene Acton в качестве контроля числа копий для подготовки реакций для QPCR. Добавьте по одному микролитру соответствующей пары грунтовок в каждую трубку. Разбавьте CD NA до соответствующей концентрации и добавьте по девять микролитров в каждую пробирку.

Наконец, добавьте 10 микролитров двух x cyberg green PCR master mix в каждую пробирку. Затем настройте программу усиления после амплификации. Вычисляем относительные уровни выражений по номеру цикла для порога, который определяется параметрами по умолчанию в программном обеспечении step one и подтверждается проверкой кривых усиления.

ПЦР-амплификация из ДНК, выделенной из листьев в различных положениях вдоль стебля, демонстрирует появление одной копии с 5,7 килооснованием, фрагмента ДНК, называемой последовательностью линейной вставки, или ЛИС, когда растения выращиваются в индуцирующих условиях. LIS one появляется, когда PL выращивается в условиях с низким содержанием питательных веществ и в конечном итоге становится гомозиготным. Здесь. Образцы листьев с первого по шестой были выделены с интервалом в неделю, причем первый образец был самым ранним после того, как из образцов была выделена ДНК.

ПЦР-амплификация выявляет наличие обоих концов LAS, одного во всех образцах, кроме первого. Это согласуется с исчезновением введенного участка и отсутствием признаков этого со стороны пятого листа QPCR. Полученные результаты показывают, что наличие у LAS тех или иных геномных изменений, связанных с индукцией, влияет на экспрессию генов в непосредственной близости от S-гена.

Все шесть генов, показанных здесь, дифференциально экспрессируются в PL и S, четыре из которых имеют более высокую экспрессию в PL, которая не имеет LIS. И наоборот, два из них имеют более высокую экспрессию в S, который имеет LIS один, мы только что показали вам, как выращивать индуцируемые линии льна. Таким образом, геном изменяется в ответ на условия роста и характеристики роста последующих поколений.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что условия роста должны быть воспроизведены для воспроизводимой индукции изменений. Вот и все. Я знаю, что многие из вас скептически относятся к этому явлению, но теперь вы можете воспроизвести эти наблюдения для себя.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.