Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

Общей целью этой процедуры является мониторинг влияния гриппа, вирусной инфекции, на прогрессирование S. pneumonia у бессимптомно колонизированных новорожденных мышей. Первые инфекционные стебли готовятся путем выращивания организмов в стандартной бульонной культуре. В случае биолюминесцентной s. pneumoniae или в куриных яйцах для гриппа, пятидневные мыши затем колонизируются S. pneumoniae через интраназальную инфекцию.

Когда мышам исполняется от 8 до 14 дней, они либо заражаются гриппом А, либо инфицируются как инфицированные. Биолюминесцентная визуализация in vivo может быть использована для мониторинга распространения S. pneumonia в легких мышей, подвергшихся коинфекции. При гриппе А в конечном итоге могут быть получены результаты, свидетельствующие об обострении и распространении биолюминесцентных пневмоний.

При гриппе вирус заражает детенышей мышей. Таким образом, основное преимущество использования этого метода по сравнению с другими широко используемыми методами, такими как вскрытие животных в каждый момент времени после эвтаназии, заключается в том, что вы можете отслеживать инфекцию у одного и того же животного с течением времени. Второе важное преимущество заключается в том, что вы можете отслеживать кинетику инфекции в органах или других местах, которые не так легко доступны, таких как среднее ухо.

Демонстрировать процедуры будет мой коллега Патрик Реддинг, который является старшим научным сотрудником отдела, Кирсти Шорт, которая является аспирантом в моей лаборатории, и я сам. Культура биолюминесцентных. S. pneumoniae собирают одну колонию бактерий, инокулируют колонию в стерильную бутылку Маккартни, содержащую 10 миллилитров бульона Тодда Хьюитта.

Дополняют 0,5%-ным дрожжевым экстрактом и кусочком кровяного шнека и инкубируют. Культура статически при 37 градусах Цельсия. Как только оптическая плотность культуры на уровне 600 нанометров достигнет 0,4-0,45, поместите культуру на влажный лед и инкубируйте ее в течение пяти минут.

Помещение культуры на лед остановит рост бактериальных клеток и сохранит клетки в этой фазе роста. Для определения инфекционного титра подвойной пластины проводят серийное разведение подвойа на кровь шнековых пластин и инкубацию тарелок при температуре 37 градусов Цельсия. В течение 18-24 часов концентрация жизнеспособных бактерий в повое может быть получена из образовавшейся колонии.

Посчитайте, чтобы сохранить бактериальный запас, добавьте к культуре 10 миллилитр стерильного, 80% глицерина. Сделайте от 200 до 500 микролитров аликвот и храните образцы при температуре минус 70 градусов по Цельсию. Вирус выращивается в аойочной жидкости 10-дневных куриных яиц путем прокалывания.

Небольшое отверстие в яичной скорлупе вируса вводится в полость Аллана Тоика через воздушный мешок. Чтобы найти полость Аллана Тоика, сначала зажгите яйцо, поместив на яйцо источник света. Отметьте расположение воздушного мешка в месте, свободном от прожилок, с помощью 70% этанола.

Продезинфицируйте поверхность яйца с помощью ювелирного писаря, проткните небольшое отверстие в скорлупе яйца на уровне воздушного мешка чуть выше отметки. Расположите яйцо отверстием к верху. В картонном держателе для яиц.

Наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 калибра, 100 микролитров вируса. Проденьте иглу через отверстие и, указывая прямо вниз, проткните через воздушный мешок в нижележащую полость Алана Тоика, где можно распределить вирус, осторожно удалите иглу с помощью расплавленного воска. Запечатайте отверстие в яичной скорлупе и поместите яйцо в инкубатор для увлажненных яиц.

Установите на 35 градусов по Цельсию. После двухдневной инкубации извлеките яйцо и зажгите его свечой, чтобы контролировать жизнеспособность эмбриона. Если видны кровеносные сосуды, эмбрион жив.

Если внутренняя часть яйца черная, то эмбрион погиб и яйцо следует выбросить. Инкубируйте яйцо в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы убить эмбрион и сузить кровеносные сосуды. Это поможет сохранить целостность кровеносных сосудов и свести к минимуму потерю вируса, которая может произойти при контакте вирусных частиц с кровью и связывании эритроцитов.

После того, как эмбрион был убит, можно собирать жидкость Алана Тоика. Продезинфицируйте поверхность яйца с помощью 70% этанола. Снимите сургучную печать и с помощью изогнутых ножниц разрежьте вокруг верхней части яйца, чтобы удалить воздушный мешок над мембраной Алана Тоика.

С помощью стерильных щипцов прокалывают и отклеивают мембрану, обнажая таким образом жидкость. Используйте одну пипетку, чтобы удерживать эмбрион в одной стороне, а другую 10-миллилитровую пипетку. Чтобы собрать жидкость Алана Тоика, соберите и оттяните жидкость из нескольких яиц в конической трубке объемом 50 миллилитров.

Выбросьте любую жидкость, если она загрязнена желтком, или центрифугу для крови, объедините жидкости Алана Тоика при 2000 оборотах в минуту в течение пяти минут, чтобы удалить мусор, соберите надосадочную жидкость, поместите ее в одну-две миллилитровые криопробирки и храните при температуре минус 70 градусов Цельсия. Титр вируса аликвот можно определить с помощью анализа бляшек: разморозить замороженную аликвоту биолюминесцентной s-пневмонии и разведить до 2000 КОЕ на три микролитра инокулюма в стерильном ПБС аккуратно взять пятидневную мышь, держа ее в вертикальном положении. С помощью стерильной пипетки капните три микролитра бактерий или PBS для ложных инфекций на ноздри.

После того, как весь инокулюм будет вдохнут, поместите мышь обратно в клетку через три-девять дней после колонизации. При биолюминесцентной S. пневмонии мыши могут быть инфицированы гриппом. Вирус сначала размораживает аликвоту инфицированной аойной жидкости и разбавляет до 20 БОЕ на три микролитра инокулюма в стерильной PBS, как показано при S. pneumonia.

Повторите интраназальную инфекцию, как показано ранее. Жидкость Алана Тоика из неинфицированных яиц может быть использована при фиктивных инфекциях. Приготовьте обезболивающий раствор из 0,75 миллиграмм на миллилитр кетамина и 1,76 мг на миллилитр ксилазина в воде для инъекций.

Введите обезболивающий раствор в брюшную полость мыши из расчета 100 микролитров на 10 грамм массы тела. Как только мышь будет полностью обезболиваена, поместите ее внутрь коробки для визуализации, осторожно расположив интересующую анатомическую область параллельно камере. Вентральное изображение позволит визуализировать дыхательные пути, в то время как боковое изображение обеспечит более чувствительный захват ушей.

Поместите коробку с мышью внутрь IVIS и обеспечьте поступление фтора Isof со скоростью 0,5 литра в минуту. Чтобы сохранить анестезию, установите аппарат IVIS на правильную платформу визуализации, а Беннинг подготовьтесь к захвату изображения. Установите время визуализации равным семи минутам и начните визуализацию, в то время как семи минут достаточно для 20-дневных черных шести мышей C 57, инфицированных нашим биолюминесцентным штаммом S. pneumoniae.

Оптимальное время захвата может варьироваться в зависимости от силы и местоположения сигнала, а также от штамма мыши или используемых бактерий. После завершения визуализации перенесите мышь в коробку, предварительно подогретую с помощью грелки, и дайте ей восстановиться после анестезии, прежде чем вернуть ее в клетку. Изображения могут быть проанализированы с помощью программного пакета живых изображений версии 3.0 от Caliper Life Sciences на мышах, колонизированных только с S. pneumonia и имитирующих коинфекцию стерильной жидкостью Алана Тоика.

Различные низкие уровни люминесценции обнаруживаются в области носа через три дня и четыре дня после заражения. В отличие от них, мыши были инфицированы как пневмонией, так и гриппом. Сильный сигнал люминесценции может быть обнаружен во всей области носоглотки, а интенсивность и размер сигнала люминесценции увеличиваются с третьего по четвертый день после заражения гриппом.

В соответствии с более сильным сигналом биолюминесценции, бактериальная нагрузка в носовой полости коинфицированных животных примерно в 100 раз выше, чем у колонизированных животных. При S. pneumonia только гриппе, вирус может быть обнаружен в носу и легких инфицированных животных. Как показано на рисунке, титр вируса гриппа А аналогичен в носу и легких коинфицированного животного на четвертый день после интраназального введения вируса.

Таким образом, следуя этому методу, такие методы, как анализ вирусных бляшек или выделение однородных тканей, могут быть использованы для получения более точного определения вирусной нагрузки и бактериальной нагрузки в тканях, представляющих интерес.