Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Общая цель данной процедуры – продемонстрировать легкость выполнения вестерн-блоттинга при использовании соответствующих продуктов. После подготовки образца белки разделяются по размеру, а затем переводятся в твердую фазу. Затем белки исследуются антителами и обнаруживаются с помощью надлежащих протоколов и высококачественных экономически эффективных реагентов, что дает улучшенные результаты вестерн-блоттинга.

Здравствуйте, я Джесси Лухан, научный сотрудник EMD Chemicals в Сан-Диего, штат Калифорния. EMD является дочерней компанией Merck, KGAA в Dharm stat Germany. Сегодня мы покажем вам процедуру вестерн-блоттинга.

Итак, приступим. Первым этапом вестерн-блоттинга является подготовка образца. Начните подготовку образцов с гранулирования ячеек с использованием низкоскоростного центрифугирования, например, в течение пяти минут при 2,500-кратном давлении тяжести.

После центрифугирования слейте воду из клеточных гранул. Хорошо ресуспендируйте клетки в реагенте для экстракции белка Cytobuster, используя 150 микролитров на 10-шесть клеток. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем вращайте образец в течение пяти минут при давлении в 16 000 раз сильнее силы тяжести при четырех градусах Цельсия после центрифугирования. Перенесите очищенную SNA в свежую пробирку и приступайте к анализу. После того, как концентрация белка в образце оценена, подготовьте образец к загрузке геля для денатурации белка.

Используйте буфер для пробы, содержащий денатурирующее детергентное средство, такое как сульфат фольги натрия или SDS. Варите смесь при температуре от 95 до 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. С помощью коммерчески доступного сборного железобетона белки могут быть быстро разделены на основе молекулярной массы.

Заполните установку электрофореза работающим буфером, который может быть изготовлен из реагентов, предлагаемых через химическую линию Omni PU. Загрузите первую полосу скважины белковым маркером Trail Mix. Этот маркер имеет три референсные полосы, которые позволяют осуществлять мониторинг во время электрофореза.

После окрашивания геля становятся видимыми 10 полос весом от 10 до 225 килограммов дальтон. Загрузите денатурированный образец в остальные лунки. Запустите гель при напряжении 220 вольт в течение одного часа.

После того, как белки разделятся, окрасьте гель синим кумаси, чтобы убедиться, что белки мигрировали равномерно и равномерно, используя быстрое окрашивание и сверхчувствительное окрашивание, которое готово к использованию без DS. Окрашивание требуется точно так же, как белки с электрическим зарядом могут перемещаться через гель в электрическом поле, так и белки могут переноситься в электрическом поле от геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза или PVDF. При использовании мембран из ПВДФ мембрану следует замочить в метаноле на несколько минут, после чего необходимо уравновесить в ледяном буфере для переноса холодного воздуха в течение пяти минут. Также замочите гель на несколько минут в ледяном буфере для переноса Е. Уравновешивание предотвращает усадку геля во время переноса.

Для влажного переноса соберите сэндвич из геля и мембраны между губкой и бумагой. Затем плотно зажмите сборку, убедившись, что между гелем и мембраной не образовались пузырьки воздуха. Погрузите сэндвич в буфер для переноса и подайте на него электрическое поле.

Отрицательно заряженные белки будут двигаться к положительно заряженному электроду. Затем мембрана останавливает их, связывает и не дает им продолжать. После завершения переноса визуализируйте белки, чтобы обеспечить равномерный перенос без воздушных карманов.

Это можно легко сделать с помощью красной тревоги от вестерн-блота. Это пятно готово к использованию, и его можно легко очистить водой. Это гель после того, как он был удален путем промывания в воде до того, как мембрана может быть подтверждена антителами, мембрана блокируется.

Чтобы предотвратить неспецифическое связывание, заблокируйте мембрану высококачественными блокирующими реагентами. Чтобы избежать повышенного фона, инкубируйте его в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре при слабом перемешивании, затем после инкубации трижды промойте мембрану в TBST или PBST. Эти буферы могут быть легко и удобно изготовлены с использованием подростковых таблеток TBS и таблеток PBS соответственно.

После того, как мембрана была заблокирована и промыта, ее можно инкубировать с первичным антителом. Применяют первичное антитело с помощью раствора, одного из усилителей сигнала, что позволяет значительно усилить сигнал. Приготовьте первичное антитело в растворе один и инкубируйте мембрану в течение одного часа.

Нет необходимости добавлять дополнительные блокирующие агенты после инкубации. Промойте мембрану с помощью TBST. Далее инкубируют мембрану с вторичным антителом, разведенным во втором растворе усиления сигнала в течение одного часа.

Наконец, еще раз промойте мембрану несколько раз TBST для конъюгированной HRP. Здесь традиционно используется обнаружение вторичных антител методом усиленной хемилюминесценции или ECL. Используется реагент ECL с быстрым шагом, так как он не требует смешивания люминола или усилителя.

Просто распылите на мембрану несколько раз, инкубируйте в течение двух минут и проявите ее с помощью рентгеновской пленки. Rapid Step обеспечивает низкую чувствительность к пикограмме, а также более легкую работу в течение двух часов после добавления подложки. Белковые маркеры Trail mix позволяют отслеживать белки во время электрофореза по сравнению со стандартными протоколами вестерн-блоттинга.

Функция усиления сигнала обеспечивает больший динамический диапазон и чувствительность. Наконец, превосходная чувствительность может быть достигнута за счет использования Rapid step вместо традиционных реагентов ECL. Мы только что показали вам, как эффективно и экономично выполнять западную ослепление с помощью широкого ассортимента продукции.

Помните, что качество ваших результатов зависит от качества ваших реагентов. Ну вот. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.