Name: Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Узнайте метод вестерн-блоттинга для анализа белков с использованием электрофореза и антител. Этот подход помогает исследователям получать надёжные результаты при детекции специфических белков.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Подготовка образцов Первый шаг в западных промокательной является пробоподготовки. Для подготовки образцов для запуска геля клетки и ткани должны быть лизируются для освобождения белков, представляющих интерес. <ul><li> Удобный, готовый к использованию реагента, который является универсальным и простым в использовании для извлечения растворимого белка CytoBuster или PhosphoSafe. Эти добычи буферы содержат моющие средства оптимизированы для эффективного извлечения растворимых белков млекопитающих и клетки насекомых. Нежный, без ионного состава CytoBuster реагента извлечения белка позволяет изоляции функционально активных эндогенных или выразили белков без необходимости вторичной очистки, такие как ультразвуком или замораживания / оттаивания. PhoshoSafe имеет дополнительное преимущество, содержащий четыре ингибиторов фосфатазы. <ol><li> Гранул клеток центрифугированием низкой скорости (например, 5 мин при 2500 мкг), процедить осадок клеток хорошо. </li><li> Ресуспендируют клеток в CytoBuster белка Добыча реагента использовании 150 мкл на 10 6 клеток (оптимальное количество реагента CytoBuster извлечения белка может меняться в зависимости от размера ячейки). </li><li> Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. </li><li> Трансфер в подходящую трубку и спина в течение 5 мин при 16 000 мкг при 4 ° C. </li><li> Передача очищается супернатант (клеточного экстракта) в новую пробирку и приступить к анализу. </li></ol></li><li> Для специализированных извлечения белка, мы рекомендуем использовать наши высококачественные ProteoExtract Kits. EMD имеет более десятка наборов для митохондриальных изоляции, субклеточном добычи протеома, добыче трансмембранного белка, и многие другие. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей. </li><li> EMD также продает широкий спектр протеаз и фосфатазы наборов ингибитор коктейль. Как только происходит лизис, протеолиз, дефосфорилирование, и денатурация начать. Эти события могут быть замедлены чрезвычайно если образцы хранятся на льду или при температуре 4 ° С во все времена и соответствующие ингибиторы добавляют в свежем виде лизис буфера. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей. </li></ul> 2. SDS-PAGE Второй шаг в западных промокательной является разделения белков. Белки отделить на основе молекулярной массой. <ul><li> Вы можете сделать свой собственный геля ПААГ, однако мы будем использовать коммерчески сборных геля. <ol><li> После подготовки образца, вы готовы для определения концентрации белка. EMD имеет два набора для этого, чтобы измерять концентрацию, один из которых без Вмешательство белка Kit пробирной, а другой Пробирной BCA белка Kit. </li><li> Как только концентрация белка оценивается мы готовы подготовить нашу выборку для загрузки геля. Антитела обычно признают небольшую часть белок (именуемые эпитопа), и этот домен может находиться внутри 3D конформации белка. Чтобы разрешить доступ антитела к этой части надо разворачиваться белка. </li><li> Для денатурации, используйте загрузки буфера с анионными денатурирующих моющего средства додецилсульфата натрия (SDS), и кипятить смесь на 95-100 ° С в течение 5 минут. Легкой и удобной погрузки буфер для использования 4X буфера проб. </li></ol></li><li> Поместите первую полосу хорошо Трейл маркерный белок Mix. Этот маркер имеет три ссылки полосы, которые позволяют контролировать электрофореза. Когда гель испачкается, 10 полос видны в пределах от 10-225 кДа. </li><li> Заполните электрофореза единицы проточной буфера. Для PAGE гелей, это, как правило 1X Трис-глицин. Для получения подробных рецептов буфера, посетить Западную промокательной странице. EMD предлагает высококачественные буферами реагентов с нашей линии химического OmniPur. Выполнить геля при 220 В в течение 1 часа. </li><li> Как только белки разделены, пятно геля Кумасси синий обеспечить белки мигрируют ровно и равномерно. RAPIDstain является сверхчувствительных пятно, которое готово к использованию. Нет destaining не требуется. </li></ul> 3. Белка-переносчика Так же, как белки с электрическим зарядом могут быть вызваны путешествовать по геля в электрическом поле, так что может быть передано белков в электрическом поле из геля на мембрану, быть или PVDF или нитроцеллюлозы. <ul><li> Сегодня мы будем делать мокрой передачи. В мокрых передачи, гель и мембрана зажаты между губкой и бумаги (губки / бумага / гель / мембрана / бумага / губка) и все зажаты плотно вместе после того, гарантируя, что ни воздушные пузыри образовались между гелем и мембраной. Сэндвич погружен в передаче буфера для которых электрические поля. Отрицательно заряженные белки путешествия к положительно заряженному электроду, но мембрана останавливает их, связывает их и не позволяет им продолжать далее. </li><li> Два типа мембран доступны: нитроцеллюлоза и PVDF. И работать хорошо. Сегодня мы будем использовать PVDF. PVDF мембраны требуют замачивания в метанол в течение нескольких минут, а затем ледяной буфера передачи в течение 5 минут. Гель также необходимо, чтобы уравновесить в течение нескольких минут в ледяной буфер передачи. Невыполнение этого требования может сократиться гель при передаче. </li><li> Буфера для влажной передачи 1X Трис-глицин, с 20% метанола. Подробная подготовка буфера доступны на нашем сайте. </li><li> После завершения передачи, это хорошая идея, чтобы визуализировать белки, чтобы гарантировать даже передачи без каких-либо воздушных карманов. Это можно легко сделать с Blot RedAlert Западной пятно. Это пятно является готовой к использованию и destaining можно легко сделать с водой. </li></ul> 4. Антитела и аксессуаров Реагенты <ul><li> Первым шагом в этом зондирования и антитела к антигену, чтобы блокировать мембраны. Блокировка мембрана предотвращает неспецифическую фоне обязательными. </li><li> Либо обезжиренного молока или БСА может быть использован как блокирование решения. Однако при использовании фосфорно-специфические антитела, это не рекомендуется использовать молоко, то это вызовет высокий фон. </li><li> EMD предлагает несколько высококачественных блокирование реагентов, в том числе SeaBlock, которая не является млекопитающим блокирующий агент и промокните QuickBlocker, который готовят, готовый к использованию блокирующий агент. У нас также есть высококачественные BSA (доля V) имеется. <ol><li> Инкубируйте мембраны 1 час при комнатной температуре, при легком волнении. </li><li> Вымойте три раза в TBST или PBST после инкубации. Легкий и удобный способ сделать TBST или PBST является использование нашего таблетки (PBS ТВИН Таблетки / TBS ТВИН таблетки) </li></ol></li><li> Как только мембрана была заблокирована, вы готовы для инкубации с первичными антителами. EMD года предлагает полный портфель исключительных антител с лучшими антител гарантии в промышленности на протяжении более 30 лет. Помните, что все антитела EMD, мы предлагаем полный 100% без риска гарантии. Покупка антитела и использовать его для любых видовой специфичности или приложения вы хотите. Если антитела не работает, чтобы Вы остались довольны, мы предоставим полный кредит, который будет использоваться на любой другой продукт. Для более подробной информации, пожалуйста, посетите наши западные промокательной веб-страницы. <ol><li> Сегодня мы будем инкубации нашей главной антител при решении 1 из SignalBoost. SignalBoost большой продукт, позволяющий вашему сигналу быть существенно увеличены. Просто инкубируйте ваших первичных антител в растворе 1 и инкубировать в течение 1 часа или, как вы это обычно делаете. Существует нет необходимости добавить дополнительные блокаторов. Кроме того, вы можете использовать BSA или обезжиренное сухое молоко, как блокирующий агент. </li><li> Промыть TBST. Мы делаем TBST использованием готовых к растворяются TBST таблетки. </li><li> Инкубируйте ваших вторичных антител при решении 2 из SignalBoost. Инкубируйте вторичные антитела в блокирующем буфере в течение 1 часа. Вымойте мембраны еще несколько раз с TBST. </li></ol></li></ul> 5. Обнаружение Для сопряжения HRP вторичными антителами, ECL традиционно используется. Отличные ECL реагента мы предлагаем RapidStep. Преимущества RapidStep в том, что нет смешивания просвета или усилитель не требуется. Просто распылите мембраны несколько раз, и развивать с помощью рентгеновской пленки. RapidStep предлагает низкую чувствительность пиктограмма, а также излучать свет в течение 2 часов после того субстрата.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Авторы Анна и Джесси Эслами Лухан являются сотрудниками EMD химических Inc, которая производит реактивы и инструменты, используемые в настоящей статье.

В этом видео-презентации, мы выделили основные шаги в западных промокательной которые пробоподготовки, SDS-PAGE, мембранные блокировка / зондирования с антителами, и обнаружения. За каждый шаг процесса, надлежащего протоколы и соответствующие реагенты должны быть использованы для достижения высоких результатов.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Реагент для экстракции белков</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или ПВДФ), где их детектируют с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;а href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Реагент для экстракции</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Метод определения содержания белка, не подверженный влиянию мешающих факторов&amp;#8482; Набор</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Набор для определения концентрации белка методом BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где их детектируют с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X буфер для подготовки образцов с SDS </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где их детектируют с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Смесь орехов и сухофруктов&amp;#8482; Белковые маркеры</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Белки&amp;#8211;экстракт&amp;#8482; Наборы для экстракции белков</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;экстракт&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;экстракт&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;экстракт&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;экстракт&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Продукты</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Реагент</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10-кратный краситель для вестерн-блоттинга</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;а href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Реагент: плазма лосося</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где их детектируют с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Реагент для быстрой блокировки BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;а href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Альбумин сыворотки быка, фракция V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детекция) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Таблетки</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг представляет собой аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков в зависимости от длины полипептида (в денатурирующих условиях) или трехмерной структуры белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где проводится их зондирование (детектирование) с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Таблетки</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в данной пробе гомогената или экстракта ткани. В этом методе применяется гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белков по длине полипептидной цепи (в денатурирующих условиях) или по трехмерной структуре белка (в нативных/неденатурирующих условиях). Затем белки переносятся на мембрану (обычно нитроцеллюлозную или PVDF), где их детектируют с помощью антител, специфичных к целевому белку.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Набор для усиления иммунореакции</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Реагент ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;Вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг)&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта. Он использует гель-электрофореза для разделения нативных или денатурированных белков длина полипептид (денатурирующих условиях) или 3-D структуры белка (родной / не денатурирующих условиях). Белки затем переведен в мембране (обычно нитроцеллюлозы или PVDF), где их опроса (обнаружен), используя антитела, специфичные к белку-мишени.

Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта.

Вестерн-блоттинг — это аналитический метод, используемый для обнаружения специфических белков в определенном образце гомогената или экстракта ткани. В данном методе используется гель...

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать простоту выполнения вестерн-блоттинга при использовании подходящих продуктов. После подготовки образцов белки разделяются по размеру, а затем переносятся на твердую фазу. Далее белки определяются с помощью антител; использование надлежащих протоколов и высококачественных экономичных реагентов позволяет улучшить результаты вестерн-блоттинга.Здравствуйте, я Джесси Лухан, специалист по исследованиям и разработкам в компании EMD Chemicals в Сан-Диего, Калифорния. EMD является филиалом Merck, KGAA в Дармштадте, Германия. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру вестерн-блоттинга.Итак, приступим. Первым этапом вестерн-блоттинга является подготовка образцов. Начните подготовку образцов с осаждения клеток путем центрифугирования при низкой скорости, например, в течение пяти минут при 2 500 ×g.После центрифугирования слейте супернатант, оставив осадок клеток. Тщательно ресуспендируйте клетки в реагенте для экстракции белков cyto buster, используя 150 µL на 10⁶ клеток. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем центрифугируйте образец в течение пяти минут при 16 000 ×g и температуре four degrees Celsius. Перенесите очищенный SNA в новую пробирку и приступайте к анализу. После определения концентрации белка в образце подготовьте его для нанесения на гель с целью денатурации белка.Используйте буфер для образцов, содержащий ионный денатурирующий детергент, такой как додецилсульфат натрия или SDS. Прокипятите смесь при температуре от 95 до 100 °C в течение пяти минут. С помощью коммерчески доступного готового геля можно быстро разделить белки по их молекулярной массе.Заполните электрофорезную камеру рабочим буфером, который можно приготовить из реагентов химической линейки Omni PU. В первую лунку нанесите белковый маркер Trail Mix. Этот маркер имеет три контрольные полосы, которые позволяют осуществлять мониторинг в процессе электрофореза.После окрашивания геля становятся видны 10 полос в диапазоне от 10 до 225 килоДальтонов. Внесите денатурированный образец в оставшиеся лунки. Проведите электрофорез в геле при напряжении 220 вольт в течение одного часа.После разделения белков окрасьте гель кумасси синим, используя экспресс-краситель и ультрачувствительный краситель (готовый к использованию, без SDS), чтобы убедиться, что белки мигрировали равномерно и единообразно. Окрашивание необходимо, поскольку белки, обладающие электрическим зарядом, могут перемещаться через гель в электрическом поле, что позволяет перенести их в электрическом поле с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозная или PVDF. При использовании PVDF-мембран погрузите мембрану в метанол на несколько минут, после чего уравновесьте ее в ледяном трансферном буфере в течение пяти минут. Также погрузите гель на несколько минут в ледяной трансферный буфер; такое уравновешивание предотвращает усадку геля во время переноса.Для проведения влажного переноса соберите «сэндвич», поместив гель и мембрану между губками и бумажными фильтрами. Плотно зажмите сборку, предварительно убедившись в отсутствии пузырьков воздуха между гелем и мембраной. Погрузите «сэндвич» в буфер для переноса и приложите электрическое поле.Отрицательно заряженные белки будут перемещаться к положительно заряженному электроду. Затем мембрана останавливает их, связывает и препятствует их дальнейшему продвижению. После завершения переноса проведите визуализацию белков, чтобы убедиться в равномерности переноса и отсутствии воздушных пузырьков.Это можно легко сделать с помощью красителя Red Alert для вестерн-блоттинга. Данный краситель готов к использованию, а обесцвечивание легко проводится с помощью воды. На изображении представлен гель после обесцвечивания путем промывки в воде; перед инкубацией мембраны с антителами ее подвергают блокировке.Для предотвращения неспецифического связывания заблокируйте мембрану с помощью высококачественных блокирующих реагентов. Чтобы избежать повышения фона, инкубируйте мембрану в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании, после чего промойте мембрану трижды в TBST или PBST. Эти буферы можно легко и удобно приготовить с использованием соответствующих таблеток TBS-Tween и PBS-Tween.После блокировки и промывки мембрану можно инкубировать с первичными антителами. Для нанесения первичных антител используйте раствор Signal Boost, который позволяет значительно усилить сигнал. Приготовьте раствор первичных антител в растворе 1 и инкубируйте мембрану в течение одного часа.После инкубации дополнительно добавлять блокирующие агенты не требуется. Промойте мембрану раствором TBST. Затем инкубируйте мембрану с вторичными антителами, разведенными в растворе два системы signal boost, в течение одного часа.Наконец, еще несколько раз промойте мембрану буфером TBST перед конъюгацией с HRP. Для детекции вторичных антител здесь традиционно используется усиленная хемолюминесценция или ECL. Используется экспресс-реагент ECL, так как он не требует смешивания люминола или усилителя.Просто распылите раствор на мембрану несколько раз, инкубируйте в течение двух минут и проявите с использованием рентгеновской пленки. Метод Rapid Step обеспечивает чувствительность на уровне низких пикограмм, а также более слабую эмиссию в течение до двух часов после добавления субстрата. Маркеры белков Trail mix позволяют отслеживать белки в процессе электрофореза по сравнению со стандартными протоколами вестерн-блоттинга.Усиление сигнала обеспечивает более широкий динамический диапазон и повышенную чувствительность. Наконец, максимально высокую чувствительность можно достичь, используя реагенты Rapid вместо традиционных реагентов для ECL. Мы только что продемонстрировали вам, как эффективно и экономично проводить вестерн-блоттинг, используя широкий ассортимент продукции.Помните, что качество ваших результатов зависит от качества используемых реагентов. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Эта техническая статья описывает стандартные западных промокательной процедуры с использованием коммерчески доступных NuPAGE электрофореза Mini-гель системы от Invitrogen.

Вестерн-блоттинг Использование Invitrogen NuPage Novex бис Трис MiniGels

Иммуноблоттинг (западной промокательной) является быстрый и чувствительный тест для выявления и характеристики белков, который работает, используя специфику присущих антиген-антитело признание. Это видео содержит протоколы для разделения белков, блоттинг белков на мембранах, immunoprobing и визуализации с помощью хромогенного или хемилюминесцентный субстраты.

Анализ Вестернблот

Это видео демонстрирует метод количественного точечного блоттинга, или QDB, для абсолютной количественной оценки белков, представляющих интерес в образце ткани. Белки в образце иммобилизованы на нитроцеллюлозной мембране внутри лунок планшета QDB. Используя целевые белок-специфические антитела, меченные ферментом пероксидазой, хемилюминесцентный субстрат окисляется с образованием света, который измеряется для определения концентрации белка в образце.

Количественный точечный блоттинг для оценки целевых белков в тканевом лизате

Видео демонстрирует технику вестерн-блоттинга, основанную на нормализации общего белка, для количественной оценки экспрессии целевого белка в образце. Используя общее окрашивание образца белком, проводят ратиометрический анализ для определения относительного уровня экспрессии целевого белка.

Количественный вестерн-блоттинг для оценки уровня экспрессии белка

Это видео описывает вестерн-блоттинг иммунопреципитированных лизатов на основе хемилюминесценции. Этот метод помогает определить процесс обработки и активации белка. Обнаруживаемый хемилюминесцентный сигнал пропорционален уровню переработки белка при его активации.

Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг для переработки белка

Этот протокол исследует новейшие достижения в выполнении Вестерн-блот анализа. Эти новые модификации используют систему гель Bis-Tris с 35 мин электрофореза время выполнения 7 мин системы передачи сухой блоттинг и инфракрасного обнаружения флуоресцентного белка и обработки изображений, который создает высокое разрешение, качество, чувствительность и повышенную точность западных данных.

Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга

Развитие вестерн-блоттинга с использованием флуоресценции позволило обнаружить тонкие изменения в экспрессии белка, что позволило провести количественный анализ. В этой статье мы описываем надежную методологию обнаружения ряда белков у различных видов и типов тканей. Также предложена стратегия преодоления общих технических проблем.

Руководство по современной количественной Люминесцентная Вестерн-блоттинга с устранения неисправностей стратегий

Этот метод описывает надежных и воспроизводимых подход для сравнения уровня белка в различных тканях и в различные области развития timepoints, с использованием стандартизированных количественных Западный blotting подход.

Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS).

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

Архивное фиксированных формалином и парафином (FFPE) клинические образцы ценный материал для исследования заболеваний. Здесь мы показываем, подготовки рабочего процесса образец, позволяющий в глубины протеомный анализ микродиссекции FFPE ткани.

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Узнайте метод вестерн-блоттинга для анализа белков с использованием электрофореза и антител. Этот подход помогает исследователям получать надёжные результаты при детекции специфических белков.

Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Больше видео