In Utero инъекций Внутрижелудочковая и электропорации E16 крысиных эмбрионов

Здравствуйте, меня зовут Уильям Ти. Я из лаборатории Штейна при Арнольд Крик. Сегодня мы с коллегами продемонстрируем вам технику внутриматочного введения в эмбрионы крыс на 16-й день развития (E 16). Здравствуйте, меня зовут Лора Элиас.

Сегодня я продемонстрирую вам, как подготовить пипетки для микроинъекций и заполнить их для проведения интравентрикулярных инъекций и электропорации, которые мы будем выполнять сегодня. Я также покажу, как проводить интравентрикулярные инъекции и электропорацию в эмбрионов крыс на стадии E16. Таким образом, инъекции и электропорация in utero у крыс особенно полезны, поскольку крыса является системой, в которой сложно проводить генетические манипуляции.

Для данной процедуры используется ряд хирургических инструментов. Мы используем фрезер, два типа адсонских пинцетов — один с насечкой, а другой с зубцом на конце, а также гемостатические зажимы.

Это ножницы, а далее мы используем эти два степлера. Этот — более крупный, который мы используем для крыс. Этот — меньшего размера, который мы используем для мышей; в нем используются скобы размера 7, а в том — скобы размера 9; оба устройства оснащены пружинным механизмом.

Для содействия проведению операций мы используем некоторые вспомогательные средства, в том числе простой волоконно-оптический источник света с двойным выходом. Мы используем нагревательный коврик, в котором циркулирует теплая вода для поддержания температуры. В качестве рабочей поверхности мы используем систему электропорации производства BTX.

Мы используем лопатки нескольких разных размеров в зависимости от того, насколько велики эмбрионы. Синяя сторона является положительной. Итак, теперь мы приступим к скосанию кончиков инъекционных пипеток.

Это очень важно, чтобы отверстие вашей пипетки было достаточно большим для загрузки ДНК, но при этом кончик был очень острым, чтобы не повредить эмбрион при инъекции. Если вы повредите эмбрион во время введения, уровень смертности будет значительно выше, что крайне нежелательно.

Этот процесс имеет большое значение при проведении данной операции. Сначала мы просто нальем немного воды на вращающийся здесь фасеточный камень. Затем мы возьмем, посмотрим, просто палочку.

Теперь мы закрепим с помощью скотча только что вытянутую пипетку на этом стержне. Для фиксации пипетки под нужным углом мы воспользуемся одним из этих микроманипуляторов. Мы установим ее и будем использовать микроскоп для визуализации кончика пипетки.

Теперь мы просто поместим его в воду, прямо на фаску, чтобы создать небольшое давление. Вы видите, как кончик прижимается к камню. Оставьте его для формирования фаски на некоторое время, как минимум на 15 минут.

Я предпочитаю оставлять их даже, скажем, на час. Иногда они становятся очень, очень острыми, но время обработки края пипеток определенно зависит от каждого конкретного человека. Итак, здесь мы видим, что сверху у нас находится вытянутая пипетка, край которой еще не был скошен.

Таким образом, несмотря на остроту, в ней нет отверстия, через которое можно было бы загрузить ДНК. Нижняя же пипетка имеет скос, и вы видите это удобное угловатое отверстие. Это позволит загрузить ДНК, но при этом кончик остается острым, чтобы инъекцию можно было провести, не нанося повреждений. Хорошо, теперь мы заполним наши инъекционные пипетки ДНК.

Поэтому важно подготовить ДНК таким образом, чтобы она не содержала эндотоксинов, чтобы при введении ДНК вы не ввели липополисахариды. Теперь мы возьмем нашу ДНК; для начала подготовим парафильм. Просто разверните парафильм, затем возьмите ДНК и нанесите её в виде маленькой капли на этот парафильм.

Затем я беру — обычно на каждые 10 µL моей ДНК, концентрацию которой я обычно поддерживаю на уровне от 1,5 до 1,7 µg/µL, — примерно один µL этого красителя FastGreen. Это необходимо для того, чтобы локализовать место инъекции и убедиться, что введение в желудочек прошло успешно.

Теперь я просто смешаю этот краситель Fast Green с моей ДНК. Затем возьмите инъекционный электрод; мы заполним пипетку, потянув поршень на себя. Как видите, если пипетка изготовлена правильно и имеет достаточно широкое отверстие, ДНК должна загрузиться довольно легко.

Иногда необходимо просто перемещать поршень вперед и назад, чтобы помочь ему правильно заполнить дозатор. После этого можно заполнить пипетку следующим образом. Теперь ДНК полностью загружена в пипетку и готова к инъекции.

Теперь я проведу анестезию животного. Мы используем эти конусы для декапитации. Я просто немного отогнул край, чтобы его было удобнее держать.

Итак, начнем. Обычно я просто помещаю его на край клетки, чтобы создать небольшой удобный туннель, в который он сможет зайти вот так. Хорошо, похоже, животное зафиксировано.

Теперь мы проведем тест на реакцию на щипок за палец ноги, чтобы подтвердить это; для этого нужно захватить палец и крепко сжать его. Не слишком сильно, чтобы не травмировать животное, но достаточно, чтобы убедиться, что оно находится под наркозом.

Это животное определенно обездвижено. Поэтому я приступаю к выбриванию шерсти на животе. Я хочу обходить соски, чтобы случайно не срезать их кончики.

Я полагаю, что эта процедура может быть очень болезненной для животного. Поэтому животное выбривают. Теперь я помещу его в вытяжной шкаф.

Мы промоем животное и приступим к процедуре. Итак, мы еще раз подтвердили, что животное находится под наркозом, и теперь готовы начать с очистки. Сначала я нанесу немного глазной мази в каждый глаз, чтобы предотвратить их пересыхание.

Затем мы будем поочередно промывать образцы, используя спиртовые и йодные салфетки. Эту процедуру повторяют трижды, чередуя протирания. Действовать нужно очень осторожно, чтобы не повредить эмбрионы в процессе выполнения данной операции.

Таким образом, вам нужно просто провести рукой вертикально вниз, прямо назад. Это первый шаг. Сначала мне нужно хорошо увлажнить поверхность, чтобы я мог приступить к протиранию. Хорошо.

Это два, и это три. Хорошо, мы наложили эту салфетку, чтобы обеспечить стерильность, и теперь я приступлю к вскрытию животного. Приступаем к разрезу.

Итак, первым делом мне необходимо надеть стерильные перчатки. Мы надеваем стерильные перчатки и готовы приступить к вскрытию. Всегда следует убедиться, что животное все еще находится под наркозом.

Теперь я снова зажму палец пинцетом; я буду делать это на протяжении всей процедуры. Обычно я так поступаю: зажимаю небольшой участок ткани, делаю быстрый разрез, захватываю ткань сверху и разрезаю ее вниз, затем беру второй пинцет и раздвигаю ткани.

Затем захватите нужную мышцу и сделайте разрез строго по срединной линии, чтобы не задеть сосуды или нервы. Будьте осторожны при захвате. Итак, похоже, мы получили хороший выход материала.

Я хочу убедиться, что образец достаточно увлажнен, чтобы он не пересох. Я добавлю еще одну порцию раствора для уверенности, и, похоже, теперь всё в порядке. Я всегда располагаю их определенным образом: я помещаю эмбрион так, чтобы его голова была направлена в правую сторону материнской крысы, исключительно для обеспечения единообразия.

Итак, я начинаю. Здесь мы видим эмбрион. Мы видим хвост и задние конечности здесь, а голову — чуть выше.

Итак, перед нами голова этого эмбриона. Здесь видна срединная линия, обозначенная этой темной чертой. Можно различить левое и правое полушария, а также задний мозг.

Теперь я приступлю к введению препарата в левое полушарие. С помощью пипетки ввожу краситель: немного приподнимаю и впрыскиваю. Теперь видно, как краситель распространяется по левому боковому желудочку.

Таким образом, инъекция прошла успешно. Теперь мы видим, что желудочки хорошо заполнились. Краситель фактически переместился из левого желудочка в правый.

Таким образом, D и ДНК находятся в обоих желудочках. Сейчас я возьму электропорационные электроды и помещу их через мозг, расположив положительный электрод с левой стороны. Таким образом, ДНК проникнет в клетки-предшественники и в корковую стенку левого полушария.

Теперь я подаю ток. Когда начинается прохождение электрического тока, на отрицательном конце электрода появляется пена. Это подтверждает правильность установки контактов.

Теперь, когда мы провели электропорацию эмбрионов, я верну их на место и зашью разрез. Сейчас я введу ей 10 мл антибиотика и наложу хирургический шов. Я предпочитаю использовать узловые швы.

После этого мы зафиксируем кожу с помощью кожного степлера. Хорошо? Хорошо. Я ввела ей дозу бупренорфина, чтобы она не испытывала боли при выходе из наркоза. Теперь я помещу ее в инкубатор; он поможет ей согреться при пробуждении, чтобы предотвратить развитие гипотермии.

Итак, мы только что продемонстрировали вам, как выполнять инъекции в желудочки мозга и электропорацию in utero. У крыс можно вводить различные вещества. Например, можно просто ввести вирус, включая лентивирус или ретровирус, непосредственно в желудочек.

В данном случае электропорация не потребуется, так как вирус интегрируется в клетки. Если же вы вводите плазмидную ДНК, как мы делали сегодня, вам придется провести электропорацию, чтобы доставить плазмиды в клетки, выстилающие желудочек. Таким образом, данные векторы можно использовать для реализации различных задач.

Их можно использовать просто для отслеживания клеток и экспрессии GFP, что позволит наблюдать за делением и миграцией этих клеток-предшественников. Эти векторы также можно использовать для манипуляций с клетками: например, для экспрессии шпилек shRNA, что позволяет осуществлять нокдаун специфических генов.

Вы также можете сверхэкспрессировать специфические гены и таким образом манипулировать клетками, которые вы подвергли электропорации или инфицировали вирусом. Это может быть очень мощным методом изучения роли конкретных белков в интересующем вас процессе. В частности, это крайне важно для исследований на крысах, поскольку проводить генетические манипуляции на крысах не так просто, как на мышах.